一、背景
人非小細胞肺癌細胞是于1987年從一名27歲白人男性(10年煙齡)支氣管肺泡癌患者的胸腔積液中分離得到的。
二、人非小細胞肺癌細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1)準備1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基：87%
特級胎牛血清：10%
GlutaMAX—I谷氨酰胺：1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉：1%
P/S青霉素-鏈霉素：1%
2)人非小細胞肺癌細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)人非小細胞肺癌細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、人非小細胞肺癌細胞處理：
1）凍存人非小細胞肺癌細胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）人非小細胞肺癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁人非小細胞肺癌細胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若人非小細胞肺癌細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將人非小細胞肺癌細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）人非小細胞肺癌細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
下面T25瓶為例；
1、人非小細胞肺癌細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的人非小細胞肺癌細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
四、應(yīng)用
人非小細胞肺癌細胞可以用于血清饑餓誘導(dǎo)肺癌細胞NCI-H1650遷移和侵襲能力增強的機制研究：
探究血清撤除對腫瘤細胞的形態(tài)、遷移能力和侵襲能力的影響,本實驗在非小細胞肺癌NCI-H1650細胞上進行了血清饑餓實驗。結(jié)果表明,血清饑餓處理后,NCI-H1650細胞在形態(tài)上由初始的上皮樣變?yōu)槌衫w維樣,且細胞運動能力、transwell遷移能力、侵襲能力均顯著增強。而且,血清饑餓處理人非小細胞肺癌細胞NCI-H1650細胞后,再加入終濃度為2%FBS(Fetal Bovine Serum)進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)饑餓后呈成纖維樣的細胞恢復(fù)為上皮樣,運動遷移能力與體外侵襲能力都明顯下降。
另外,為了探究血清饑餓處理引起的人非小細胞肺癌細胞NCI-H1650細胞遷移能力、侵襲能力提高是否跟EMT有關(guān),本實驗從蛋白水平、mRNA水平驗證了EMT相關(guān)標志物的表達水平(Vimentin,Snail1,E-Cadherin),結(jié)果表明細胞在2%FBS的條件下,轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達量較低,但在血清饑餓處理的細胞中表達量明顯上調(diào),加入2%FBS恢復(fù)后Snail1表達量又顯著下調(diào)。
為了進一步明確Snail1是否在血清饑餓誘導(dǎo)NCI-H1650細胞運動侵襲能力增強的過程中發(fā)揮重要作用,本實驗對人非小細胞肺癌細胞NCI-H1650細胞進行siRNA干擾實驗,使Snail1基因沉默后再進行血清饑餓處理,結(jié)果顯示,與對照相比,無論在含有2%FBS條件下或者血清完全撤除的條件下,Snail1敲低后形態(tài)和遷移能力均沒有顯著差異。
由此得出結(jié)論:饑餓刺激下誘導(dǎo)的遷移能力、侵襲能力的提高與EMT無關(guān)。為了找到調(diào)控血清饑餓促進NCI-H1650細胞運動侵襲的關(guān)鍵調(diào)控因子,本研究鑒定了應(yīng)激信號傳導(dǎo)相關(guān)通道,例如MAPK,并借助通路抑制劑進行藥理學(xué)實驗驗證,最后發(fā)現(xiàn)在血清饑餓條件下,ERK蛋白磷酸化水平顯著升高,從而使細胞形態(tài)發(fā)生改變,并促進細胞的侵襲和遷移。
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