一、背景
小鼠脂肪干細(xì)胞分離自脂肪組織；脂肪組織主要由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，聚集成團(tuán)的脂肪細(xì)胞由薄層疏松結(jié)締組織分隔成小葉；貯存的脂肪，在需要時(shí)可迅速分解成甘油和脂肪酸，經(jīng)血液輸送到各組織以供利用。它們影響胰島素敏感性、血壓水平、內(nèi)皮功能、纖溶活動(dòng)及炎癥反應(yīng)，參與多種重要病理生理過程；脂肪組織已由過去單純作為能量儲(chǔ)存的器官而成為一個(gè)極其重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，主要恢復(fù)組織細(xì)胞的修復(fù)功能，促進(jìn)細(xì)胞的再生，恢復(fù)年輕面容的同時(shí)，身體機(jī)能也得到充分改善，有效改善亞健康、早衰等疾病，由內(nèi)而外真正的有效抵抗衰老。
小鼠脂肪干細(xì)胞具有很多優(yōu)點(diǎn)：①具有自我更新及多向分化的潛能；②來源充足；③對(duì)供區(qū)的創(chuàng)傷較?。虎塬@得率及體外擴(kuò)增速率高。脂肪干細(xì)胞是目前被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域中理想的種子細(xì)胞。
二、小鼠脂肪干細(xì)胞使用方法
1、收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時(shí)或過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
2、小鼠脂肪干細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.125%胰蛋白酶消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3、小鼠脂肪干細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.125%胰蛋白酶消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入完全培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；
3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期保存。
4、小鼠脂肪干細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無菌離心管中，滴加入完全培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；
3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、應(yīng)用
小鼠脂肪干細(xì)胞可以用于促進(jìn)脂肪干細(xì)胞移植后存活和自體脂肪移植存活的研究：
殼聚糖支架負(fù)載SHH和CM-Dil標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞移植后存活分化研究：
目的：觀察SHH、殼聚糖支架聯(lián)合或分別使用對(duì)體內(nèi)移植的脂肪干細(xì)胞存活和分化的影響。
方法：將健康C57BL/6小鼠隨機(jī)分為A組(PBS+ADSCs)、B組(SHH+ADSCs)、C組(殼聚糖+ADSCs)、D組(殼聚糖+SHH+ADSCs)。將各組混合物分別注射到小鼠背部皮下。術(shù)后1、2、4、8周處死小鼠,通過對(duì)移植組織一般觀察、熒光顯微鏡觀察、HE染色、免疫組化染色、TUNEL染色來評(píng)價(jià)移植細(xì)胞存活分化的情況。[結(jié)果]術(shù)后八周,殼聚糖支架完全降解,大體觀察、HE染色、免疫組化染色、TUNEL凋亡染色均說明殼聚糖支架同時(shí)搭載SHH和ADSCs脂肪干細(xì)胞存活率較高,血管新生增加,效果均優(yōu)于A、B、C三組。
結(jié)論：殼聚糖支架同時(shí)負(fù)載SHH和ADSCs可有效促進(jìn)干細(xì)胞存活,顯著增加血管組織數(shù)量。
第二部分硫化氫提升小鼠脂肪移植存活率的研究：
目的：探討提高血硫化氫(hydrogensulfide,H2S)濃度是否可以提高自體脂肪移植的存活率。
方法：選取18只6周齡健康BALB/c小鼠,將其隨機(jī)分為3組.即空白組(單純顆粒脂肪)、H2S組(單純顆粒脂肪)、SHH(Sonichedgehog,SHH)組(顆粒脂肪混合SHH,混合后SHH濃度為500μg/L),每組6只。將各組混合物注射入BALB/c小鼠背部皮下,H2S組術(shù)后每日腹腔注射硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)溶液50μmol/kg。術(shù)后1、2、4周處死小鼠,通過對(duì)手術(shù)取出的移植組織包塊進(jìn)行一般觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、HE染色、免疫組化染色來評(píng)價(jià)移植組織存活及血管新生的情況。
結(jié)果：大體觀察、annexin V-FITC/Pi細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)流式結(jié)果顯示第一周凋亡率SHH組低于H2S組,H2S組低于空白組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第二周凋亡率H2S組與SHH組結(jié)果相近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,H2S組與SHH組均低于空白組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HE染色鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示SHH組與H2S組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,SHH組、H2S組數(shù)量均大于空白組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)及免疫組化染色均說明H2S可以提高移植組織存活率,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)新生血管增殖。
結(jié)論：提高血H2S濃度可以有效抑制移植組織細(xì)胞凋亡壞死,促進(jìn)血管新生。
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