一、背景
乳糖培養(yǎng)基用于多管發(fā)酵法測定食品、純凈水和一次性使用衛(wèi)生用品中大腸菌群的確證試驗(GB/T4789.3-2003，GB/T4789.28-2003中4.10和GB15979-2002)。
二、乳糖培養(yǎng)基原理
蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求;乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類;溴甲酚紫是pH指示劑，酸性呈黃色，堿性呈紫色。
三、乳糖培養(yǎng)基使用方法
1、稱取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基)30g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝于帶有小倒管的試管中，每管9mL(檢測藥品時每管3ml)，115℃高壓滅菌15min。
2、從平板上挑取可疑菌落接種乳糖發(fā)酵管，(食品)置36±1℃培養(yǎng)24±2h;(藥品)置30～35℃培養(yǎng)24～48h。
3、觀察結(jié)果。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色陰性的無芽孢桿菌，即為大腸菌群陽性，(食品)查MPN表報告每克(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
四、乳糖培養(yǎng)基質(zhì)量控制
本品加熱溶解后呈紫色，下列菌株接種后置36±1℃培養(yǎng)24h或者30～35℃培養(yǎng)24～48h，結(jié)果如下：乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。
五、應(yīng)用
乳糖培養(yǎng)基可以用于產(chǎn)β-葡聚糖酶的重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl的誘導(dǎo)表達及發(fā)酵：
β-1,3-1,4-葡聚糖酶能夠有效地降解植物和微生物細胞壁來源的β-葡聚糖,通過添加外源β-葡聚糖酶可有效解決啤酒釀造中麥汁過濾困難,啤酒的非生物穩(wěn)定性降低等問題,在飼料工業(yè)中也可提高禽畜對麥類飼料養(yǎng)分的吸收效率。
目前啤酒工業(yè)及飼料加工業(yè)中使用的β-葡聚糖酶制劑,主要是利用真菌或芽孢桿菌經(jīng)傳統(tǒng)通風(fēng)發(fā)酵而生產(chǎn)。近年來,將外源β-葡聚糖酶基因通過合適的質(zhì)粒載體克隆到大腸桿菌中進行表達得到了廣泛的研究和應(yīng)用。
本研究室自行構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl,該菌克隆了源自一株淀粉液化芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的高產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,在乳糖或IPTG的誘導(dǎo)下可實現(xiàn)重組葡聚糖酶的表達。本文針對影響重組菌表達效果的因素(如菌體的生長狀態(tài)、誘導(dǎo)劑的最優(yōu)作用條件、培養(yǎng)基的組成等)對誘導(dǎo)表達條件進行了優(yōu)化,并初步進行了7升規(guī)模的放大發(fā)酵實驗。
所得的主要結(jié)論如下：
1、在25 mL起始pH為7.0的LB培養(yǎng)基中,接入10%(以0.35的OD值為分值)處于對數(shù)中期的二級種子液,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為1.0左右時加入誘導(dǎo)劑,此時β-葡聚糖酶相對酶活最高。
2、采用正交實驗的方法優(yōu)化了在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的作用條件,得到的最佳誘導(dǎo)參數(shù)為:IPTG濃度0.0336 mmol/L,乳糖濃度10 mmol/L,誘導(dǎo)溫度24℃,誘導(dǎo)時間6 h。發(fā)酵清液酶活達到336.33 U/mL,較優(yōu)化前提高44.3%,該酶活是原始菌的4.85倍。
3、利用Plackett-Burman design實驗設(shè)計方法對初始培養(yǎng)基中各組分進行了主效應(yīng)分析,其中的甘油、酵母粉、氯化鈉為主效應(yīng)因子。采用Box-Benhken實驗設(shè)計,以及MATLAB7.0的響應(yīng)面回歸(RSREG)和NESS數(shù)據(jù)處理軟件對實驗結(jié)果進行分析,得到了三個主效應(yīng)因子的最佳濃度及最佳培養(yǎng)基組成(g/L):甘油18.9,酵母粉45.6,NaCl5.3,胰蛋白胨5.0,KH2PO42.8,K2HPO4.3H2O
4、8。最優(yōu)濃度下酶活預(yù)測最大值為2053.1U/mL,菌種在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h,酶活最高達到了2311.81 U/mL,超過預(yù)測值,與優(yōu)化前相比,酶活提高了23.04%。4.7升規(guī)模放大發(fā)酵13 h,發(fā)酵清液中的酶活最高為4189.58 U/mL,與三角瓶發(fā)酵最優(yōu)結(jié)果相比提高了81.23%,該酶活是原始菌在最優(yōu)條件下的酶活(853.33 U/mL)的4.91倍。
以上結(jié)果不僅為重組菌的進一步放大發(fā)酵提供了可靠的參考依據(jù),也預(yù)示了該重組菌有著較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
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