一、背景
小鼠胰島Β細胞來源于轉基因小鼠中生長的一個胰腺腫瘤(胰島素瘤)。這種小鼠攜帶了大鼠胰島素II基因啟動子調控的SV40早期基因的假基因結構。細胞包含豐富的胰島素和小量的胰高血糖素及生長抑素。
二、小鼠胰島Β細胞處理
1）凍存小鼠胰島Β細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）小鼠胰島Β細胞傳代：如果細胞密度達70%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
該細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞，傳代可以參考以下方法：
1.收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）小鼠胰島Β細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
三、應用
小鼠胰島Β細胞可以用于基于小鼠胰島β細胞系MIN6構建兩種常用胰島體外模型的比較研究：
基于小鼠胰島β細胞系Min6細胞構建無支架的細胞球和封裝于海藻酸凝膠中的分散細胞二種不同的三維(three-dimensional,3D)細胞培養(yǎng)體系。與傳統(tǒng)的二維(two-dimensional,2D)貼壁細胞相比,比較這三種培養(yǎng)方式下胰島素分泌功能的差異并對其存在的機制進行初步的研究。
方法：
(1)采用Solid-works設計出深度、直徑可調的模具,利用3D打印技術制備出模具,并構建瓊脂糖微孔矩陣培養(yǎng)3D Min6細胞球;
(2)采用海藻酸鈉封裝MIN6細胞構建3D細胞微囊,采用Calcein AM/PI死活染色檢測不同濃度的海藻酸鈉水凝膠以及解交聯(lián)劑對MIN6細胞微囊存活的影響;
(3)采用Cell Titer-Glo(?)3D化學發(fā)光法評估MIN6細胞在不同濃度的海藻酸鈉水凝膠以及2D,3D培養(yǎng)下的增殖差異;
(4)掃描電子顯微鏡觀察細胞球和海藻酸鈉微囊的表面特征。
(5)實驗分組:2D組、細胞球組、細胞微囊組;
(6)Western blot、IF、RT-q PCR分別檢測Min6細胞胰島功能相關蛋白GLUT2、PDX1、Insulin(INS)和基因GLUT2、PDX1、INS2、NKX2.2的表達差異;
(7)酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA檢測葡萄糖刺激Min6細胞下的胰島素分泌差異;
(8)Western Blot檢測三種培養(yǎng)方式下胰島素分泌相關信號通路PI3K/AKT/FoxO1的表達變化;
(9)Western Blot檢測不同濃度的海藻酸鈉封裝的細胞胰島素分泌相關信號通路PI3K/AKT/FoxO1的表達變化。
結果：
(1)瓊脂糖表面可形成整齊排列的微孔矩陣,MIN6細胞在微孔內可聚集形成大小均一,緊密的細胞球。
(2)死活染色與增殖結果顯示,1%(w/v)海藻酸鈉水凝膠裝封適合MIN6細胞生長。
(3)增殖檢測結果顯示,二種3D培養(yǎng)均能有效促進MIN6細胞的增殖。
(4)掃描電鏡結果顯示,細胞球之間細胞互相融合、緊密聚集成微組織,細胞在水凝膠基質上形成單層簇狀或多細胞簇狀在局部生長。
(5)免疫熒光結果顯示,GLUT2,PDX1,INS的信號強度,細胞球組最明顯,水凝膠組和2D組差異不明顯。
(6)ELISA結果顯示高糖或低糖刺激下,與2D相比,3D培養(yǎng)促進胰島素分泌量更高(P<0.05),其中水凝膠組胰島素分泌高于細胞球組(P<0.05)。
(7)RT-q PCR結果顯示,3D培養(yǎng)有利于促進GLUT2、PDX1、INS2和NKX2.2基因的表達,其中水凝膠組對基因表達的上調作用最大(P<0.001)。
(8)Western blot結果顯示,MIN6細胞在不同培養(yǎng)條件下,GLUT2的表達無顯著性差異,PDX1,INS表達趨勢和RT-q PCR一致。
(9)Western blot結果顯示,PI3K,p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1和PDX1蛋白的表達水平,水凝膠組明顯高于其他兩組(P<0.05)。其中,細胞球組的表達水平也比2D組高,統(tǒng)計沒有顯著差異。
（10不同濃度水凝膠封裝MIN6細胞,Western blot結果顯示,PI3K的表達,0.5%和1%(w/v)差異不明顯,2%(w/v)的顯著降低(P<0.05);p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1,PDX1的表達1%表達最高(P<0.05),0.5%和2%(w/v)之間無顯著性差異。
結論：
成功構建了細胞球和適合海藻酸鹽水凝膠封裝細胞培養(yǎng)的二種三維培養(yǎng)方式；與傳統(tǒng)的2D貼壁培養(yǎng)相比,三維培養(yǎng)條件下細胞增殖和胰島相關基因和蛋白的表達顯著增強,并促進胰島素分泌。其中,封裝于海藻酸鈉凝膠中的細胞比細胞球高表達。
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