一、背景
DT40雞淋巴瘤細(xì)胞是來自Hyline SC雞法氏囊淋巴細(xì)胞株經(jīng)鳥類白血病病毒誘導(dǎo)建株的。原始淋巴瘤用羅氏相關(guān)病毒1(RAV-1)感染出生１天的小雞得到。法氏囊中生成的腫瘤制成細(xì)胞懸液后通過靜脈注射輸入同基因型的受體小雞。經(jīng)過一次體內(nèi)移植后，建立了DT40細(xì)胞株。這株細(xì)胞包含的前病毒基因整合在c-myc原癌基因的上游，表達(dá)的c-myc RNA水平較高。它缺少一個正常c-myc基因，但含有兩個拷貝ALV去調(diào)控的myc基因。這株細(xì)胞保留了重排免疫球蛋白輕鏈基因(IgL)的能力。
在IgL位點(diǎn)，DT40包含一個重排和一個胚系同源基因。c-rel基因和v-rel癌基因在DT40細(xì)胞株中都能誘導(dǎo)組織相容性(MHC)II類抗原表達(dá)。v-rel誘導(dǎo)的MHCII表達(dá)比c-rel誘導(dǎo)快，且其有效性在數(shù)周后達(dá)到c-rel的50倍。這株細(xì)胞呈淋巴母細(xì)胞表型。傳染性檢測表明DT40釋放低水平的傳染性RAV-1。這株細(xì)胞可以用于穩(wěn)轉(zhuǎn)研究。
二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雞血清，5%；b-巰基乙醇，0.05mM；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
三、應(yīng)用
用于REV感染對HD11和DT40細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響研究：
針對REV免疫抑制的特征,選取HD11（雞巨噬細(xì)胞系）和DT40（雞淋巴瘤細(xì)胞）為研究對象,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)方法結(jié)合檢測試劑盒,通過對REV感染上述細(xì)胞后病毒載量、細(xì)胞線粒體膜電位和Ca2+含量及細(xì)胞凋亡率等進(jìn)行檢測,同時測定了細(xì)胞線粒體途徑重要凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量變化。
主要研究結(jié)果如下：
（1）于REV感染的HD11、DT40細(xì)胞中均檢測到了該病毒,表明REV可在HD11和DT40細(xì)胞中復(fù)制增殖。且在病毒感染HD11細(xì)胞后48 h,病毒載量到達(dá)峰值;REV感染DT40細(xì)胞后12-72 h,其病毒載量均呈上升趨勢。
（2）REV感染HD11細(xì)胞后24-36 h,其細(xì)胞活力極顯著（P<0.01）低于對照細(xì)胞。REV感染DT40細(xì)胞后,其細(xì)胞活力在12 h顯著（P<0.05）低于對照細(xì)胞,在48h極顯著（P<0.01）低于對照細(xì)胞。
（3）REV感染HD11和DT40細(xì)胞后,其細(xì)胞線粒體膜電位分別在病毒感染后36-48 h、36-72 h顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）低于對照細(xì)胞。
（4）REV感染HD11和DT40細(xì)胞后,其細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量均在36 h和48 h顯著（P<0.05）高于對照細(xì)胞;其余時間點(diǎn)雖也高于對照細(xì)胞,但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
（5）REV感染HD11細(xì)胞后24-36 h和72 h,其細(xì)胞凋亡率均極顯著（P<0.01）高于未感染病毒的對照細(xì)胞,12 h雖然病毒感染細(xì)胞凋亡率較對照細(xì)胞有所增加,但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）;REV感染DT40細(xì)胞后12 h、48 h和72 h,DT40細(xì)胞凋亡率極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞。
（6）REV感染HD11細(xì)胞后,其Bcl-2 mRNA表達(dá)在24-36 h極顯著（P<0.01）低于對照細(xì)胞,而48-72 h顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞;Bax mRNA表達(dá)在24 h顯著（P<0.05）低于對照細(xì)胞,在48 h和72 h顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞;caspase-3 mRNA表達(dá)在36 h和72 h極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞;caspase-9mRNA表達(dá)在12 h、36 h和72 h顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞。
REV感染DT40細(xì)胞后,其Bcl-2 mRNA表達(dá)在12 h、48-72 h均極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞;Bax mRNA在12-72 h期間均未能檢測到表達(dá)（Ct值≥35）;caspase-3 mRNA表達(dá)在24 h極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞,在36 h和72 h顯著（P<0.05）高于對照細(xì)胞;caspase-9 mRNA表達(dá)在24-36h極顯著（P<0.01）高于對照細(xì)胞,在72h顯著（P<0.05）高于對照細(xì)胞;其他均未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
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