一、背景
人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞源自一位女性肝膽管細(xì)胞癌患者，呈上皮細(xì)胞樣。HCCC-9810細(xì)胞染色體模式數(shù)為71，但其染色體數(shù)目可以在22-117的范圍內(nèi)變動。HCCC-9810細(xì)胞倍增時間為20.4小時；細(xì)胞內(nèi)AFP、CEA和CA19-9的分泌水平低，HCCC-9810細(xì)胞在裸鼠中的成瘤率為20%。
二、人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的培養(yǎng)
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞處理
1）凍存人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。
四、應(yīng)用
人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞可以用于谷氨酰胺酶2介導(dǎo)MDR1表達(dá)調(diào)控肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶化療敏感性的研究：
探討GLS2在ICC中的化療耐藥的作用及其潛在機制。
方法：首先,通過UALCN在線分析工具在生物信息數(shù)據(jù)庫中檢索ICC中GLS2、MDR1表達(dá)水平及兩者的相關(guān)性。運用Western blot、免疫組化臨床進(jìn)一步驗證40例ICC組織、癌旁組織GLS2和MDR1表達(dá)水平及兩者相關(guān)性并分析,GLS2表達(dá)水平與臨床病理因素及患者預(yù)后之間的相關(guān)性。然后,過表達(dá)RBE細(xì)胞GLS2表達(dá),Western blot驗證過表達(dá)效率。之后使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)法檢測過表達(dá)GLS2細(xì)胞及NC細(xì)胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的化療敏感性。
最后,Western blot檢測過表達(dá)GLS2的ICC細(xì)胞及NC細(xì)胞MDR1的表達(dá),初步闡明GLS2調(diào)控ICC化療耐藥潛在分子機制。
結(jié)果：
1、數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示在ICC癌組織中GLS2表達(dá)水平顯著低于正常肝組織,而MDR1表達(dá)水平顯著高于正常肝組織,并且GLS2表達(dá)與MDR1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步Western blot和免疫組化驗證,可以得到與之前一致的結(jié)果。GLS2蛋白表達(dá)與腫瘤數(shù)量、包膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān),GLS2表達(dá)越高,ICC患者預(yù)后越好。
2、上調(diào)RBE細(xì)胞GLS2表達(dá)后,可顯著提高RBE細(xì)胞對5-氟尿嘧啶化療敏感性。
3、上調(diào)RBE細(xì)胞GLS2表達(dá)后可顯著降低MDR1表達(dá)。
結(jié)論：GLS2通過介導(dǎo)MDR1表達(dá)提高ICC細(xì)胞對5-氟尿嘧啶化療敏感性化療敏感性,并且GLS2的表達(dá)越高提示患者預(yù)后越好。
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