一、背景
人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)1995年建系，人宮頸高分化鱗癌裸小鼠移植瘤HCC94V第2代瘤組織，貼壁培養(yǎng)，6日細(xì)胞開始生長，首次傳代38日，BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下移植成瘤。
二、人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人子宮鱗癌細(xì)胞(高分化)可以用于極光激酶A對宮頸鱗狀細(xì)胞癌的影響及其機(jī)制研究：
用極光激酶A選擇性小分子抑制劑MLN8237聯(lián)合DPP、多西他賽對宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(HCC94、SiHa)的體外影響,并檢測MLN8237對宮頸永生化細(xì)胞系H8的影響以檢測MLN8237對正常細(xì)胞的毒性反應(yīng),同時(shí)探討用極光激酶A抑制劑對宮頸鱗狀細(xì)胞癌放射治療的影響及對化放療增敏的機(jī)制。
方法：
1)采用免疫組化方法檢測極光激酶A在未接受任何治療的129例初始接受根治性放射治療的維吾爾族宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者組織中的表達(dá)水平,放射治療給予外照射+內(nèi)照射(A點(diǎn)劑量70-85Gy)伴或不伴順鉑為基礎(chǔ)的化療,分析極光激酶A不同表達(dá)水平對預(yù)后意義。
2)以MLN8237,DPP,多西他賽,各單藥組作用于HCC94、Si Ha細(xì)胞,并設(shè)調(diào)零組及不加藥對照組,采用MTT比色法測各組HCC94、SiHa細(xì)胞的增殖抑制率;
3)以MLN8237高劑量處理H8細(xì)胞,MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖抑制率。
4)以各藥物小劑量濃度聯(lián)合作用24h,采用MTT比色法測各組HCC94、Si Ha細(xì)胞的增殖抑制率。
5)以三者1/2 IC50(48h)組合,IC50(48h)組合,采用MTT比色法測各組HCC94、SiHa細(xì)胞的增殖抑制率。
6)以克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上MTT結(jié)果。
7)以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy放射劑量單獨(dú)或聯(lián)合MLN8237觀察HCC94、Si Ha細(xì)胞平板克隆形成率,利用單擊多靶模型擬合生存曲線,并計(jì)算外推值N,平均致死劑量D0和準(zhǔn)閾劑量Dq以及放射增敏比SER。
8)流式檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞后細(xì)胞周期、凋亡。MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,設(shè)立對照,劃痕檢測遷移能力。MLN8237處理HCC94、Si Ha細(xì)胞,Q-PCR檢測極光激酶A mRNA的變化,蛋白印跡檢測極光激酶A蛋白、磷酸化(T288)極光激酶A蛋白的變化。
結(jié)果：
1)極光激酶A表達(dá)水平與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)的因素相關(guān),包括淋巴轉(zhuǎn)移(P<0.001),腫瘤體積大(P<0.001),低血紅蛋白水平(P=0.011)和復(fù)發(fā)(P<0.001)。極光激酶A高表達(dá)和低表達(dá)臨床放射治療反應(yīng)有差異,極光激酶A高表達(dá)患者放射治療反應(yīng)相對抗拒(P<0.001)。單因素分析顯示淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大、低血紅蛋白水平、極光激酶A過表達(dá)影響無復(fù)發(fā)生存和總生存。然而,多因素分析顯示只有極光激酶A高表達(dá)可作為無復(fù)發(fā)生存(hazard ratio,3.953;95%CI,1.473-10.638;P=0.006)和總生存(hazard ratio 9.091;95%CI 2.597-32.258;P<0.001)的獨(dú)立預(yù)后因素。
2)MLN8237單藥處理細(xì)胞時(shí),各組對HCC94、Si Ha細(xì)胞生存率均比對照組降低(P<0.05),隨著給藥時(shí)間延長,細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)。DPP、多西他賽也呈同樣趨勢。與對照相比,MLN8237的濃度高達(dá)80uM時(shí)沒有引起H8細(xì)胞活性降低(P>0.05),甚至高達(dá)320u M時(shí)僅導(dǎo)致小量毒性(細(xì)胞存活率85%)。
3)MLN8237與DDP或者多西他賽聯(lián)合處理各細(xì)胞24h時(shí),各濃度聯(lián)合作用組均較相同濃度單藥存活率降低(P<0.05)。MLN8237與DDP或者多西他賽聯(lián)合組各藥物之間有交互作用,各藥物最高濃度聯(lián)合組效果最好。三藥1/2 IC50(48h)濃度聯(lián)用HCC94、SiHa細(xì)胞存活率分別僅為15.859±4.657%,18.678±5.387%;三藥IC50(48h)聯(lián)用HCC94、Si Ha細(xì)胞存活率更低分別僅為6.957±5.846%,9.561±6.241%。進(jìn)一步在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。
4)單擊多靶模型繪制出細(xì)胞輻射存活曲線,可見無論是HCC94細(xì)胞,還是SiHa細(xì)胞,聯(lián)合組曲線較單純照射組左移,且較為平直,“肩區(qū)”不明顯。
5)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MLN8237處理24h細(xì)胞,與對照組比較,明顯抑制細(xì)胞遷移。流式細(xì)胞周期檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,與對照組比較,G2/M期明顯增加,多倍體細(xì)胞比例明顯增高,G0/G1+S期比例明顯降低(P<0.05);流式細(xì)胞凋亡檢測MLN8237處理HCC94、SiHa細(xì)胞,與對照組比較,凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05),并隨時(shí)間和劑量增加,變化越明顯。
6)MLN8237處理前后極光激酶A mRNA未見顯著性差異,極光激酶A蛋白也未見明顯變化,(T288)磷酸化極光激酶A蛋白表達(dá)顯著被抑制,甚至表達(dá)消失。
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