一、背景
SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系于1990年由J.-G.Park及其同事取自一名韓國(guó)患者的間變性肝細(xì)胞癌，該患者已通過(guò)脂質(zhì)體加多柔比星和絲裂霉素-C的組合進(jìn)行了經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞治療。既可以附著細(xì)胞也可以懸浮細(xì)胞。懸浮的細(xì)胞是可行的，不應(yīng)丟棄。通過(guò)溫和離心(125 xg)回收懸浮細(xì)胞，以與貼壁細(xì)胞群一起進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
二、SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1）準(zhǔn)備1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
注：上皮樣細(xì)胞，多數(shù)貼壁，懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞同時(shí)存在。傳代凍存時(shí)請(qǐng)收集懸浮細(xì)胞。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系可以用于SKA3促進(jìn)肝癌細(xì)胞“干性”的實(shí)驗(yàn)研究：
觀察SKA3對(duì)肝癌細(xì)胞“干性”的影響并初步探討其分子機(jī)制。
方法：
(1)首先依據(jù)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析后的結(jié)果,采用Western blot檢測(cè)32例肝癌患者中SKA3在癌和癌旁組織中的表達(dá)差異,并進(jìn)行臨床預(yù)后的相關(guān)性分析;
(2)分別用si RNA、SKA3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒下調(diào)或上調(diào)肝癌細(xì)胞中SKA3的表達(dá),通過(guò)浮球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Sorafenib抵抗實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞“干性”生物學(xué)行為的變化;
(3)病毒構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKA3低表達(dá)或高表達(dá)的MHCC-97h細(xì)胞后,我們利用有限稀釋法進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察SKA3對(duì)肝癌細(xì)胞“干性”生物學(xué)行為的影響;
(4)最后采用Western blot檢測(cè)上調(diào)或下調(diào)SKA3后肝癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子如Notch1、NICD等表達(dá)的變化;再使用慢病毒敲低MHCC-97h中的Notch1,檢測(cè)SKA3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響,初步探討其分子機(jī)制。
結(jié)果：
(1)發(fā)現(xiàn)SKA3在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,且通過(guò)生物信息技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)SKA3與肝癌患者生存時(shí)間、臨床病理分期呈正相關(guān);
(2)在肝癌細(xì)胞MHCC-97h、SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系下調(diào)SKA3表達(dá)后,si SKA3組與NC組相比,其自我更新能力(SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系:P<0.01)、化療抵抗能力(MHCC-97h:P<0.0001;SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系:P<0.001)、克隆形成能力(MHCC-97h:P<0.001;SNU-398:P<0.01)、增殖能力(MHCC-97h:P<0.0001;SNU-398:P<0.0001)、遷移(MHCC-97h:P<0.01;SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系:P<0.01)及侵襲能力(MHCC-97h:P<0.001;SNU-398人肝癌貼壁細(xì)胞系:P<0.01)均顯著減弱。相反在肝癌細(xì)胞上調(diào)SKA3表達(dá)后,上述肝癌細(xì)胞“干性”化能力均明顯增強(qiáng),結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
(3)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,MHCC-97h下調(diào)SKA3表達(dá)后,裸鼠皮下瘤體積小于對(duì)照組(P<0.05),而上調(diào)SKA3表達(dá)后,裸鼠皮下瘤體積大于對(duì)照組(P<0.05);(4)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)SKA3后,肝癌內(nèi)Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子Notch1、NICD、Hes1表達(dá)明顯減少,而上調(diào)SKA3后,上述Notch信號(hào)通路分子表達(dá)顯著增高。抑制Notch信號(hào)通路后,SKA3對(duì)MHCC-97h的增殖能力(P<0.01)及遷移能力(P<0.01)的促進(jìn)作用均被抑制。
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