一、背景
正常大鼠腎細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞系，源自大鼠腎臟組織，并通過(guò)克隆培養(yǎng)而得來(lái)。該細(xì)胞系具有上皮細(xì)胞樣的形態(tài)，并具有貼壁生長(zhǎng)的特性。
正常大鼠腎細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，推薦使用DMEM培養(yǎng)基，并添加5%的胎牛血清和1%的雙抗。該細(xì)胞系的傳代比例通常為1:2，并在消化2-3分鐘后進(jìn)行。
正常大鼠腎細(xì)胞的生長(zhǎng)特征是每周可以倍增2至3次，其凍存條件為使用90%的FBS和DMSO的混合液作為凍存液，溫度為液氮。
正常大鼠腎細(xì)胞廣泛用于科學(xué)研究，特別是在腎病研究領(lǐng)域中具有重要作用。然而，它并不應(yīng)用于動(dòng)物或人類疾病的治療。
二、正常大鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、正常大鼠腎細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）正常大鼠腎細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
正常大鼠腎細(xì)胞可以用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬對(duì)順鉑誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響：
通過(guò)體外復(fù)制“順鉑(Cisplatin)致NRK-52E細(xì)胞損傷模型”來(lái)模擬順鉑腎毒性,探究順鉑致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,并觀察利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；切苋パ跄懰徕c(TUDCA)、自噬抑制劑氯喹(CQ)后腎小管上皮細(xì)胞的凋亡情況,為研究其醫(yī)治靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)方法：
1、MTT法檢測(cè)Cisplatin對(duì)NRK-52E細(xì)胞活性的影響;
2、Annexin V-FITC/PI雙染、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞凋亡率;
3、Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、LC3-Ⅱ的表達(dá);
4、RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖;5.Hoechst染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,順鉑對(duì)細(xì)胞活性的影響呈劑量依賴性;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Cisplatin及聯(lián)合TUDCA、CQ能增加NRK-52E細(xì)胞凋亡率;Western blot結(jié)果顯示,順鉑組凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP、自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)高于對(duì)照組;RTCA檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線相比,順鉑組、TUDCA+順鉑組、CQ+順鉑組的生長(zhǎng)曲線明顯下降,且TUDCA+順鉑組、CQ+順鉑組下降更明顯;Hoechst染色結(jié)果顯示,順鉑組、TUDCA+順鉑組、CQ+順鉑組,與對(duì)照組相比,凋亡核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
1、順鉑致腎小管上皮細(xì)胞損傷引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬。
2、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制自噬,明顯增加了順鉑對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
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