一、背景
UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系是起源于10日齡的ELL-0雞蛋的雞細胞株，自發(fā)永生化。分離原代雞胚成纖維細胞并在培養(yǎng)液中培養(yǎng)；傳代直到衰老；在衰老過程中離心以保持細胞培養(yǎng)在30%到60%滿；不衰老的克隆進行鑒定并傳代不少于30次。在軟瓊脂上沒有觀察到克隆增殖，說明這些細胞是永生化而沒有轉化。該細胞可作為病毒增殖、重組蛋白表達和重組病毒生產的基質。
二、UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞培養(yǎng)操作規(guī)程
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM（NaHCO3 1.5g/L）培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗1%；細胞凍存后復蘇存活率只有50%左右，建議加大凍存密度。
2）UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：39℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
2、UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞處理：
1）復蘇UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。
2）UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于39℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據客戶需要自己決定。
3）UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
1，UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數板計數。
2，4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度1-2xE6/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系可以用于雞DF-1細胞中STAT1基因缺失對傳染性法氏囊病毒和新城疫病毒增殖的影響：
以細胞基質生產病毒疫苗具有安全高效的特點,如UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系、非洲綠猴腎細胞(Vero)等常用細胞作為基質在疫苗生產中發(fā)揮巨大作用。然而,由于細胞免疫的原因,很多類型的病毒并不能在這些細胞中擴增,或者擴增效率很低。隨著人們對免疫信號通路相關基因研究的深入,采取基因編輯技術將細胞或動物的內源性免疫基因進行敲除,可從根本上改變細胞免疫性狀,進而優(yōu)化疫苗生產工藝,提高疫苗生產效率。STAT1基因在信號轉導和轉錄激活的關鍵性作用可影響免疫信號通路發(fā)揮作用。
對UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系中STAT1基因進行敲除,探究STAT1-ko細胞對傳染性法氏囊病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)病毒增殖的影響。
研究結果如下：
1、通過CRISPR/Cas9技術敲除UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系中的STAT1基因為了得到STAT1基因穩(wěn)定敲除的UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系,針對STAT1第二外顯子上設計了3個sg RNA打靶位點,將構建好的sg RNA敲除載體共同轉染雞DF-1細胞,通過挑單細胞克隆的方式收集轉染陽性細胞并進行PCR鑒定和測序分析。結果顯示,STAT1基因的打靶位點發(fā)生了堿基片段缺失,造成了編碼閱讀框的移碼突變,說明我們得到了STAT1穩(wěn)定敲除的UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系。為了驗證敲除STAT1基因后對雞DF-1細胞生長速度和細胞形態(tài)的影響,首先,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài);其次,采用細胞計數繪制兩種細胞的生長曲線;隨后,通過q-PCR檢驗兩種細胞生長與黏附相關基因編輯表達量。結果顯示,與野生型DF-1細胞相比,STAT1-ko細胞生長速度和細胞形態(tài)沒有顯著差異,細胞生長及黏附相關基因的表達量差異不顯著,說明敲除STAT1基因并未對UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系的生長速度和細胞形態(tài)產生影響。
2、敲除STAT1基因對DF-1細胞感染IBDV的影響本試驗用IBDV感染STAT1基因缺失和野生型兩種細胞,然后對其進行q-PCR和TCID50檢驗,探究敲除STAT1基因對雞DF-1的影響。結果顯示,與野生型DF-1細胞相比,STAT1-ko細胞中STAT1下游的OASL等免疫相關基因表達量顯著降低,IBDV的基因表達量和滴度均顯著提高,說明STAT1-ko細胞對IBDV的敏感性提升,IBDV在細胞內的增殖速度顯著提升。
3、敲除STAT1基因對UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系感染NDV的影響本研究用NDV感染STAT1基因缺失和野生型兩種細胞,然后對其進行q-PCR和TCID50檢驗,探究敲除STAT1基因對雞DF-1的影響。結果顯示,與野生型DF-1細胞相比,STAT1-ko細胞中STAT1下游的OASL等免疫相關基因和干擾素等免疫基因的表達量均顯著降低,NDV基因的表達量和病毒滴度均顯著提高,說明STAT1-ko細胞對NDV的敏感性提升,NDV在細胞內的增值速度顯著提升。
綜上所述,本研究通過CRISPR/Cas技術對UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞系中的STAT1基因進行敲除,IBDV和NDV在STAT1缺失雞DF-1細胞增殖速度提高。研究結果為雞STAT1基因后續(xù)研究和雞DF-1細胞的后續(xù)應用提供了重要參考。
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