一、背景及概述
阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazalii)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter ) 成員之一。雖然該菌并不常見，但其是能引起新生兒腦膜炎的危險性較大的一種病原菌。該菌為革蘭氏陰性、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大小為(0.3～1.0)μm×(1.0～6.0)μm。最適生長溫度為37℃。具有運動性，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性，發(fā)酵多種糖類產酸產氣。吲哚和甲基紅實驗陰性，VP實驗陽性。其抵抗力較弱，通常巴氏殺菌就能夠殺死，但是有時在超高溫滅菌(UHT)乳和乳粉中發(fā)現有該菌污染。目前，微生物學家尚不清楚阪崎腸桿菌的污染來源，但許多病例報告表明嬰兒配方粉是目前發(fā)現的主要感染渠道。阪崎腸桿茵的生物學性狀及其對人群的健康危害受到人們的關注并被報告。
阪崎腸桿菌是奶粉(乳)制品中新發(fā)現的一種致病菌。由其引發(fā)的嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎散發(fā)和暴發(fā)的病例已在全球相繼出現。多份研究報告表明嬰兒配方奶粉是當前發(fā)現致嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結腸炎的主要感染渠道，在某些情況下，由阪崎腸桿菌引發(fā)疾病而導致的死亡率可達40％～80％。阪崎腸桿菌已引起世界多國相關部門的重視。據報道，國外乳業(yè)巨頭曾因此被召回。在美國FDA2002年在本土某一些國際乳業(yè)巨頭生產的嬰兒配方奶粉中檢出阪崎腸桿菌后，2003年又一家國際乳業(yè)巨頭公司主動召回在美國生產的一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產兒特殊配方奶粉，阪崎腸桿菌從此成為世界矚目的焦點。
二、檢測方法
1、一種快速檢測篩選阪崎腸桿菌的方法。
步驟包括：
(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁納米粒子，15～35℃混合反應10～60min，使免疫化超順磁納米粒子與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；
(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化的超順磁納米粒子，洗滌后加入免疫化熒光量子點，15～35℃混合反應10～60min，使之與載于免疫化超順磁納米粒子的致病微生物阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；
(3)利用外加磁場吸引作用下收集載于免疫化超順磁納米粒子的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；
本方法首先制備具有超順磁性的四氧化三鐵納米粒子，在納米粒子表面包裹二氧化硅，然后表面修飾氨基，使之能與抗體結合，具有生物相容性。然后將特異性的抗體偶聯在磁性顆粒表面，使之能與樣品中被檢微生物食源性致病菌阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合。載有致病微生物阪崎腸桿菌的免疫化超順磁納米粒子在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，利用外加磁場(2000～6500Gs)吸附磁性粒子收集上述免疫化超順磁納米粒子，棄去檢樣混合液；在此基礎上，將被特異性抗體偶聯的免疫化熒光量子點加入到濃集后的反應體系中，使之與載于磁性顆粒的致病微生物阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合。提供外加磁場，被載于磁性顆粒并且偶聯有熒光量子點的目標微生物阪崎腸桿菌向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，利用外加磁場(2000～6500Gs)吸附磁性粒子收集磁性粒子，可進行熒光定性定量檢測。
若樣品中含有阪崎腸桿菌，通過上述方法，可將免疫化的熒光量子點(間接)連接到免疫化超順磁納米粒子，經過磁性收集，進行熒光檢測；復合物結構：免疫化熒光量子點-阪崎腸桿菌-免疫化超順磁納米粒子。本方法不僅能從各種樣本中迅速分離目標菌，同時加以高效富集，且分離后的細菌經快速的熒光標記，既能通過熒光顯微鏡定性鑒定，又能被熒光分光光度計定量的檢測。整個檢測過程僅需2個小時，操作方便、簡單，可靠性好，對配套設備要求低。
2、阪崎腸桿菌的分子檢測方法
采用單引物等溫擴增方法，以SYBER GreenⅡ 為熒光染料，實時熒光檢測儀檢測擴增的實時熒光信號，即以實時熒光定量PCR檢測擴增信號，具體過程包括如下步驟：
（1）取含阪崎腸桿菌的待檢樣品，提取基因組DNA；
（2）建立阪崎腸桿菌的實時熒光單引物等溫擴增的25 μL反應體系：其中RNA/DNA組合引物為2.8μmol/L、Blocker為0.2 μmol/L、Mg2+為5.0 mmol/L、dNTPs為1.0 mmol/L、BST DNA聚合酶為20U、RNase H酶為2.5U、RNase Inhibitor為32U、SYBER GreenⅡ為0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBER GreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至 60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上55℃反應40min，反應過程中實時監(jiān)測熒光信號；
（3）檢測分析：分析檢測數據；所述引物選用GGUCCGAC-TCACGAAAGCC 5’端8nt堿基為RNA序列，3’端11nt堿基為DNA序列；Blocker選用CGACGACCACGACA ，3’端用生物素修飾，中間隨機加上兩個IXNA修飾。本檢測方法可用于嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌檢測。
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