一、背景
大鼠外周血中性粒細(xì)胞采用密度梯度離心法制備而來(lái)，細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
外周血中性粒細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)是外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞（Mo）是在血液中循環(huán)的未成熟的吞噬細(xì)胞。作為一種遞呈抗原的免疫細(xì)胞，他們能吞噬和降解微生物和顆粒物質(zhì)。單核細(xì)胞能夠分化為幾類(lèi)不同的細(xì)胞類(lèi)型。單核細(xì)胞最常見(jiàn)的應(yīng)用是體外分化成為單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（moDC），巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)胞以及它們作為吞噬免疫細(xì)胞在免疫學(xué)和感染生物學(xué)方面的作用。
二、細(xì)胞操作
1、取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
2、待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3、細(xì)胞傳代
1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；
3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2-1:3適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
三、應(yīng)用
用于大鼠外周血中性粒細(xì)胞在較長(zhǎng)細(xì)菌刺激時(shí)期內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)特性及其意義研究：
研究了較長(zhǎng)細(xì)菌刺激時(shí)期內(nèi)（約300分鐘）大鼠外周血中性粒細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)特性及其意義。主要采用細(xì)胞耗氧、化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)方法研究系統(tǒng)氧耗變化，活性氧物質(zhì)生成反應(yīng)，用細(xì)菌培養(yǎng)方法研究中性粒細(xì)胞抑菌殺菌機(jī)制，采用細(xì)胞培養(yǎng)、染色、光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)方法研究測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬功能。
在細(xì)菌與外周血混合后，血細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）系統(tǒng)產(chǎn)生兩個(gè)相互分離的ROS生成峰，即ROS峰Ⅰ和ROS峰Ⅱ。ROS峰Ⅰ在刺激后立即出現(xiàn)，30分鐘以?xún)?nèi)消失，峰值小，伴有耗氧增強(qiáng)；ROS峰Ⅱ在刺激后60分鐘左右出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間可達(dá)150分鐘以上，峰值明顯高于峰Ⅰ，不伴耗氧現(xiàn)象。
ROS峰Ⅰ的大小與細(xì)菌濃度成正比，其峰值出現(xiàn)時(shí)間無(wú)明顯改變；ROS峰Ⅱ隨細(xì)菌濃度增加，其峰值出現(xiàn)時(shí)間明顯提前，峰值逐漸增加。整個(gè)歷時(shí)近300分鐘的反應(yīng)過(guò)程中，用辣根過(guò)氧化物酶未測(cè)出細(xì)胞外發(fā)光信號(hào)，表明整個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜通透性無(wú)明顯變化，其發(fā)光反應(yīng)主要來(lái)自細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。
顯然，ROS峰Ⅰ和ROS峰Ⅱ具有明顯不同的生物學(xué)活性，并且代表兩類(lèi)不同功能狀態(tài)的細(xì)胞。用綠膿桿菌等進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠全血具有明顯的抑菌殺菌作用，此作用與中性粒細(xì)胞直接相關(guān)，但與血漿成份無(wú)直接關(guān)系。全血抑菌殺菌過(guò)程可分成兩個(gè)截然不同的階段，即在ROS峰Ⅰ前期的快速抑菌殺菌期和其后的緩慢抑菌殺菌期?？焖僖志鷼⒕谥屑?xì)菌滅活率高達(dá)90％左右，此作用在反應(yīng)開(kāi)始后3分鐘內(nèi)基本完成。
此時(shí)，中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的程度并不明顯，吞噬細(xì)菌中性粒細(xì)胞的比例僅占總粒細(xì)胞的5％以下，顯然，此間的抑菌殺菌現(xiàn)象與中性粒細(xì)胞的胞外作用機(jī)制有關(guān)。在緩慢抑菌殺菌期，中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的作用隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，在ROS峰Ⅱ之后（反應(yīng)后200-250分鐘），其吞噬率可達(dá)30％-60％。吞噬中性粒細(xì)胞的比例以及單位粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的程度與反應(yīng)系統(tǒng)中活菌數(shù)量的減少幅度基本相似，因此，中性粒細(xì)胞的吞噬及胞內(nèi)機(jī)制可能在緩慢抑菌殺菌期中起著重要的作用。
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