一、背景
人宮頸癌細胞是第一個來自人體組織經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)獲得的非整倍體上皮樣細胞系，它由Gey GO等在1951年從31歲女性黑人的宮頸癌組織建立。經(jīng)原始組織切片重新觀察，Jones等將其診斷為腺癌。已知該細胞系含有人乳頭狀瘤病毒HPV18序列，需在2級生物安全防護臺操作。該細胞角蛋白陽性，p53表達量較低，但表達正常水平的pRB（視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制因子）。
二、人宮頸癌細胞接收后的處理
1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染。
2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。
4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。
三、人宮頸癌細胞的培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備MEM（推薦iCell-0012）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
1.細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
四、應用
人宮頸癌細胞可以用于淫羊藿素誘導人宮頸癌細胞凋亡及其機制的研究：
對淫羊藿素抑制宮頸腺癌細胞株HeLa和鱗狀上皮細胞癌細胞株SiHa的效果以及ROS在其抗癌活性中的作用進行了探討。
首先,MTT實驗顯示淫羊藿素處理48小時后,HeLa和SiHa兩種癌細胞的生長均受到顯著抑制(IC50分別為12.5和17μM),而非惡性的CCD?1095Sk成纖維細胞和HEK293人胚腎上皮細胞則只受到輕微影響,說明淫羊藿素對癌細胞有選擇性毒性。其次,淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞3小時后,細胞內(nèi)ROS水平即已顯著升高,而用N-乙酰半胱氨酸(NAC)阻斷ROS升高后,淫羊藿素的抑制作用即基本消失,說明淫羊藿素引起的ROS升高是其對HeLa和SiHa細胞選擇性毒性的基礎。接下來的堿性彗星電泳實驗表明淫羊藿素處理12小時后,HeLa和SiHa細胞內(nèi)DNA斷裂數(shù)量顯著上升,加入OGG1 DNA糖苷酶后DNA斷裂數(shù)進一步升高,而NAC處理阻止了淫羊藿素所致DNA斷裂的上升,說明淫羊藿素處理所致ROS升高引起了顯著的DNA氧化損傷,由此導致了大量DNA鏈斷裂。
免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理6小時后γH2AX和53BP1陽性細胞數(shù)均顯著增多,用NAC處理后顯著減少,進一步證明淫羊藿素處理引起了大量DNA損傷并激發(fā)了DNA損傷反應(DDR)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CDC25C-pS216隨淫羊藿素處理濃度的加大而升高,而CDK1-pT14水平下降。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞24小時后,發(fā)生了G2/M期細胞周期阻滯,NAC處理阻斷了CDC25C和CDK1蛋白的變化以及G2/M期周期阻滯,顯示DNA損傷反應激活了G2/M細胞周期檢驗點且與淫羊藿素所致ROS有關。
Western blot檢測同時顯示活化的caspase 3和caspase 9以及Bax蛋白隨淫羊藿素處理濃度的加大而升高,而Bcl-2和XIAP蛋白下降;流式細胞術和線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞后,凋亡細胞比例呈時間依賴性增加,而NAC處理降低了凋亡蛋白的變化以及凋亡細胞數(shù)的上升,顯示ROS所致DNA損傷反應同時激活了細胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明淫羊藿素處理前后HPV E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均無明顯改變,提示淫羊藿素對HeLa和SiHa的細胞毒性與HPV病毒基因的表達無關。
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