一、背景
人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞該細(xì)胞來源于一位3歲的白人Burkitt淋巴瘤患者；EBV陰性；表達(dá)IL-4受體和低親和性IgE受體（CD23）；每個細(xì)胞表面大約有1500個IL-4的結(jié)合位點；分泌IgM（lamdaL）；表達(dá)膜型和分泌型的免疫球蛋白。
B細(xì)胞淋巴瘤是B細(xì)胞發(fā)生的實體腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型眾多，經(jīng)典霍奇金淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤，現(xiàn)在被認(rèn)為是起源于B細(xì)胞的腫瘤。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤（MALT）、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）5種B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤最為常見，占非霍奇金淋巴瘤的3/4。B細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后和治療取決于淋巴瘤的具體類型以及分期分級。
二、人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程
1、人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基（RPMI-1640，GIBCO）；北美胎牛血清（滅活），10%；雙抗1%。
2）人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。懸浮細(xì)胞凍存時，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞可以用于EBV體外轉(zhuǎn)染人B淋巴細(xì)胞方法的優(yōu)化及B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系的體外建立：
探討CpG基序和CD40激發(fā)型抗體(5C11)對EBV轉(zhuǎn)化的作用,從而優(yōu)化B-LCLs建系的方法,對于體外利用和研究B淋巴細(xì)胞株具有重要的理論價值和潛在的運用意義。
1、EBV體外轉(zhuǎn)染人B細(xì)胞方法的優(yōu)化
探討體外建立健康人外周血的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCLs)的優(yōu)化方法及其影響因素。
方法：用EB病毒感染健康人外周血中分離的單個核細(xì)胞(PBMC),加入CD40激發(fā)型抗體(5C11)、CpG DNA免疫調(diào)節(jié)基序以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖,環(huán)胞菌素A(CysA)抑制T淋巴細(xì)胞的活性。光學(xué)顯微鏡下觀察LCLs的形態(tài)特征,利用流式細(xì)胞術(shù)分析LCLs膜表面分子CD19的表達(dá)水平。
結(jié)果：PBMC經(jīng)EBV感染3周后轉(zhuǎn)化成永生化B淋巴母細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化后的B淋巴母細(xì)胞體積增大積聚成團(tuán),可進(jìn)一步分裂增殖并長期傳代培養(yǎng)。CD40激發(fā)型抗體(5C11)及CpG免疫調(diào)節(jié)基序聯(lián)合運用,明顯地提高了EBV轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化后的LCLs保持了成熟B淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特征。
結(jié)論：CD40信號激發(fā)和CpG免疫調(diào)節(jié)基序聯(lián)合運用有效地促進(jìn)EBV對人B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及體外建系。
2、人B淋巴母細(xì)胞系的體外建立及生物學(xué)活性鑒定
體外建立健康人外周血的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCLs)并鑒定其生物學(xué)活性。
方法：光學(xué)顯微鏡下觀察,并做Giemsa染色,觀察LCLs的形態(tài)特征;提取LCLs的總RNA,檢測EB病毒潛伏膜蛋白基因LMP1的存在;利用流式細(xì)胞術(shù)分析LCLs膜表面分子CD19、CD40的表達(dá)水平。
結(jié)果：PBMC經(jīng)EBV感染3周后轉(zhuǎn)化成永生化B淋巴母細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化后的B淋巴母細(xì)胞體積增大積聚成團(tuán),可進(jìn)一步分裂增殖并長期傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后的LCLs含有LMP1基因,并保持了成熟B淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特征。
結(jié)論：用EBV體外轉(zhuǎn)染方法成功建立B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系,轉(zhuǎn)化后的B淋巴母細(xì)胞能持續(xù)分裂,并保持了成熟B淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特性。
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