一、背景
人膽管癌細(xì)胞是從源于肝內(nèi)膽管樹(shù)的中分化腺癌患者的惡性腹水細(xì)胞中建立的。
二、人膽管癌細(xì)胞接收后的處理
1）收到細(xì)胞后，活細(xì)胞首先觀察培養(yǎng)瓶是否完好，培養(yǎng)液是否漏液，培養(yǎng)基是否渾濁；凍存細(xì)胞是否干冰已揮發(fā)完，凍存管蓋是否脫落，破碎。
2）人膽管癌細(xì)胞處理：
①?gòu)?fù)蘇的細(xì)胞：如果是T-25培養(yǎng)瓶活細(xì)胞，收到后請(qǐng)用75%的酒精對(duì)培養(yǎng)瓶表面進(jìn)行消毒處理，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中靜置2~3h后再進(jìn)行后續(xù)處理。
②凍存細(xì)胞：如果是干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞，收到后請(qǐng)立即轉(zhuǎn)入液氮存儲(chǔ)或者短暫（24h）放置-80度冰箱保存，或者直接進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。
三、人膽管癌細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考
1、人膽管癌細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制人膽管癌細(xì)胞完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）人膽管癌細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺(tái)中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對(duì)貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、人膽管癌細(xì)胞傳代
1）待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%-90%匯合度時(shí)，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無(wú)菌PBS潤(rùn)洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時(shí)間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細(xì)胞脫落下來(lái)成單個(gè)細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無(wú)菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度調(diào)整比例），分別加入到2個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、人膽管癌細(xì)胞凍存
1）按照細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺(tái)內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計(jì)數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無(wú)血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個(gè)/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存。
四、應(yīng)用
人膽管癌細(xì)胞可以用于miR-92a-3p靶向腎母細(xì)胞瘤過(guò)表達(dá)基因調(diào)節(jié)人膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的分子機(jī)制研究：
通過(guò)對(duì)已發(fā)表的膽管癌公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析,最終篩選出在m RNA和蛋白水平表達(dá)都顯著上調(diào)的腎母細(xì)胞瘤過(guò)表達(dá)基因(Nephroblastoma overexpressed gene,NOV)并深入分析其功能,進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其在膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用以及分子機(jī)制的研究。
NOV(又名CCN3)是CCN家族6個(gè)成員之一?；贑CN家族在腫瘤生物進(jìn)程中扮演的重要角色,我們對(duì)其家族6個(gè)成員在10種泛癌數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明NOV在不同腫瘤病人中具有差異表達(dá)多樣性,其中在膽管癌、卵巢癌、胰腺癌中顯著上調(diào),在其他7種腫瘤中顯著下調(diào)。
膽管癌中,NOV是CCN家族6個(gè)成員中上調(diào)表達(dá)最顯著的分子。NOV已被證明可以調(diào)節(jié)多種人類(lèi)癌癥中的多種病理生理過(guò)程,但其在膽管癌中的高表達(dá)和生物學(xué)功能仍然未知。本研究旨在探討NOV對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的調(diào)控作用。首先我們通過(guò)熒光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NOV在兩種CCA細(xì)胞HCCC9810(以下簡(jiǎn)稱(chēng)9810)和RBE中是否和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)(NOV在CCA中高表達(dá))一致,然后連接NOV基因于pc DNA3.0載體中使其在9810和RBE細(xì)胞中有效過(guò)表達(dá),并將該實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(pc DNA3.0)和過(guò)表達(dá)組(NOV);應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)將靶向NOV的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染至9810和RBE細(xì)胞中,有效沉默NOV的表達(dá),并將該實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(si-NC)和沉默組(si-NOV-1,si-NOV-2)。
依次分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):在9810和RBE細(xì)胞中通過(guò)q-PCR和Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞中NOV的m RNA和蛋白表達(dá)情況;通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察NOV對(duì)9810和RBE細(xì)胞增殖能力的影響;利用細(xì)胞劃痕和Transwell小室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)NOV對(duì)9810和RBE細(xì)胞遷移能力的影響;利用Transwell小室微孔膜上室面均勻涂上基質(zhì)膠進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),以此來(lái)觀察NOV對(duì)9810和RBE細(xì)胞侵襲能力的影響;利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中上皮標(biāo)志物蛋白E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物蛋白Vimentin,N-cadherin,Snail和MMP9的表達(dá)水平;利用Western Blot技術(shù)探究NOV下游調(diào)控分子;利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析,探究micro RNA調(diào)控NOV在CCA細(xì)胞中的上調(diào)機(jī)制。
結(jié)果顯示,NOV在9810和RBE中的表達(dá)顯著高于正常人膽管上皮細(xì)胞HIBEC(P<0.001)。過(guò)表達(dá)NOV顯著促進(jìn)了9810和RBE細(xì)胞的遷移和侵襲,相反的,沉默NOV顯著抑制了9810和RBE細(xì)胞的遷移和侵襲。但NOV對(duì)9810和RBE細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)。
此外,過(guò)表達(dá)NOV的9810和RBE細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表達(dá)顯著上調(diào);相反的,沉默NOV的9810和RBE細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表達(dá)顯著下調(diào),說(shuō)明NOV可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞9810和RBE的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)進(jìn)程。
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