一、背景
大鼠胚胎心肌細(xì)胞是一株由Kimes·B和Brandt·B從BD1X大鼠胚胎心臟組織的克隆細(xì)胞株亞克隆得到的細(xì)胞株；H9c2(2-1)細(xì)胞表現(xiàn)出許多骨骼肌的特性。H9c2(2-1)細(xì)胞中的成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)。如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，H9c2(2-1)細(xì)胞融合發(fā)生得很快。
二、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、大鼠胚胎心肌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）大鼠胚胎心肌細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠胚胎心肌細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、大鼠胚胎心肌細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）大鼠胚胎心肌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）大鼠胚胎心肌細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
三、應(yīng)用
大鼠胚胎心肌細(xì)胞可以用于miRNA-193a-3p對(duì)大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡功能的影響：
胚胎心臟發(fā)育和先心病的發(fā)生受多種遺傳因素共同調(diào)節(jié),TBX1(T-box factor1)基因、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路都已被證實(shí)是其中較為重要的環(huán)節(jié)。
前期研究發(fā)現(xiàn),TBX1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)TGF-β2及其通路的靶向調(diào)控可能是通過下調(diào)miR-193a-3p的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,但這條通路如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的調(diào)控、對(duì)細(xì)胞功能有何影響目前仍不明確。鑒于許多miRNA對(duì)相關(guān)生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)控都依賴于對(duì)細(xì)胞的增殖或凋亡的調(diào)節(jié),本研究將從miR-193a-3p對(duì)大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響入手,推斷其參與心臟發(fā)育和先天性心臟病發(fā)病的可能作用機(jī)制。
方法：
(1)將miR-193a-3p mimics,miR-193a-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染至大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2,qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
(2)以CCK-8法分別檢測(cè)miR-193a-3p過表達(dá)和表達(dá)減低后細(xì)胞增殖能力的變化。
(3)流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC/PI雙染法)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后心肌細(xì)胞的凋亡水平。
(4)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件分析(計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
結(jié)果：
(1)與NC組相比,miR-193a-3p過表達(dá)后H9C2細(xì)胞的增殖受到抑制(P<0.01),而miR-193a-3p表達(dá)減低后心肌細(xì)胞的增殖活性增加(P<0.05)。
(2)與NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimics 48h后H9C2細(xì)胞的凋亡率增高(P<0.05),而轉(zhuǎn)染miR-193a-3p inhibitor 48h后心肌細(xì)胞的凋亡率減低(P<0.05),上述二者的改變均以早期凋亡為主。
結(jié)論：miR-193a-3p能夠負(fù)向調(diào)節(jié)大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2的增殖,正向調(diào)控其凋亡,其中對(duì)凋亡的調(diào)控環(huán)節(jié)可能位于凋亡早期;miR-193a-3p可能通過抑制心肌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡參與心臟發(fā)育和先天性心臟病的發(fā)生。
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