一、背景
INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞是一種大鼠胰島素瘤細(xì)胞系，它是由一名患有胰島素瘤的大鼠中分離出來的。這種細(xì)胞系在腫瘤學(xué)研究中具有重要價值，因為它可以用于評估新的治療方法和藥物的有效性，以及研究胰島素瘤的發(fā)生和發(fā)展機制。
INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞通常被用于體外實驗?zāi)Ｐ停缂?xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)表達等技術(shù)。研究人員可以通過改變培養(yǎng)條件、添加生長因子或使用基因編輯技術(shù)來改變INS-1E細(xì)胞系的行為，以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境并提高治療效果。此外，INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞還可以用于研究腫瘤微環(huán)境對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。
二、INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法
1、INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。
三、應(yīng)用
INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞可以用于IL-1β和IFNγ介導(dǎo)胰島INS-1E細(xì)胞凋亡的機制：
研究炎性因子IL-1β、IFNγ聯(lián)合介導(dǎo)胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的機制。
方法：
1、收集臨床Ⅱ型糖尿病人和正常人的血清并記錄基本資料，用ELISA試劑盒分別檢測糖尿病組和正常組血清中IL-1β和IFNγ的含量并進行組間比較；
2、將INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞分為對照組和凋亡組，對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，凋亡組用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子培養(yǎng)基刺激48小時。MTS檢測兩組細(xì)胞的活力并進行組間比較；光學(xué)顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)的變化；houchest33253對兩組細(xì)胞的細(xì)胞核進行染色并用熒光顯微鏡觀察兩組細(xì)胞細(xì)胞核的變化；
3、免疫熒光染色法對兩組細(xì)胞中Bax以及線粒體進行標(biāo)識，并用熒光顯微鏡觀察Bax在細(xì)胞中與線粒體位置關(guān)系的變化；Western blot檢測兩組細(xì)胞中蛋白質(zhì)磷酸化水平、蛋白表達量的變化并進行組間比較；
4、將無意義質(zhì)粒、TCTP過表達質(zhì)粒、shRNA阻斷質(zhì)粒分別包被在腺病毒中侵染INS-1E細(xì)胞，侵染48小時后得到空載體組、TCTP過表達組、TCTP阻斷組三組細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察自帶綠色熒光的質(zhì)粒在三組細(xì)胞中的表達效率；Western blot檢測三組細(xì)胞蛋白中TCTP表達量的變化；用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子培養(yǎng)基分別作用于三組細(xì)胞，作用時間為48小時，MTS檢測三組細(xì)胞的活力，用TCTP過表達組和TCTP阻斷組的細(xì)胞活力分別與空載體組的細(xì)胞活力進行比較。
結(jié)果：
1、ELISA檢測糖尿病組與正常組血清的IL-1β與IFNγ的含量：結(jié)果顯示糖尿病組血清中IFNγ的濃度為0.29ng/L，與正常組（0.08ng/L）之間的差異有顯著性意義（P<0.01）；糖尿病組IL-1β的濃度為0.38ng/L，與正常組（0.12ng/L）之間的差異也有顯著性意義（P<0.01）。
2、MTS檢測結(jié)果證實凋亡組細(xì)胞活力（0.28）與對照組（0.68）之間差異有顯著性意義（P<0.01）；
3、光鏡下凋亡組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮而對照組細(xì)胞形態(tài)良好；熒光顯微鏡下houchest33258標(biāo)識的凋亡組INS-1E細(xì)胞系|大鼠胰島素瘤細(xì)胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等典型的凋亡形態(tài)改變，而對照組細(xì)胞核形態(tài)正常；對照組線粒體和Bax都均散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，而凋亡組中線粒體出現(xiàn)聚集同時Bax向線粒體遷移并與線粒體形成共定位；
4、Western blot檢測凋亡組的細(xì)胞蛋白并與對照組進行比較發(fā)現(xiàn)凋亡組中TCTP的表達量降低，P53和cleaved caspase-3的表達量升高；凋亡組中Bcl-2家族內(nèi)具有拮抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1表達量降低；Bcl-2家族內(nèi)具有促進凋亡作用的Bax和Bad蛋白表達量變化不明顯；凋亡組中反映細(xì)胞增殖活力的激酶AKT活性降低；
5、熒光顯微鏡下三組細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光質(zhì)粒均大量表達；過表達組TCTP水平升高，阻斷組TCTP水平降低；MTS檢測結(jié)果顯示TCTP過表達組的細(xì)胞活力（0.49）與空載體組（0.35）之間差異有顯著性意義（P<0.01），而TCTP阻斷組（0.27）的細(xì)胞活力與空載體組（0.35）之間差異有顯著性意義（P<0.05）。
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