一、產(chǎn)品信息
平臺編號：Bio-73228
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細胞信息：M14
細胞名稱：人黑色素瘤細胞系M14
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶x1;1.5ml凍存管x2
細胞數(shù)量：1x10^6;1x10^6
保存溫度：37℃;-198℃
運輸方式：常溫保溫運輸；干冰運輸
安全等級：1
用途限制：僅供科研2類
培養(yǎng)體系：90%DMEM+10%FBS+1%三抗
培養(yǎng)溫度：37℃
二氧化碳濃度：5%
簡介：人黑色素瘤細胞系M14取自33歲男性供體。貼壁培養(yǎng)。
用途：研究
注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準）
二、知識背景
人黑色素瘤細胞株源自一位54歲女性，是由D·J·Giard等人建立的一系列細胞株中的一株。A-375細胞在抗胸腺細胞球蛋白、血清處理的NIH瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長的皮下腫瘤；A-375在普通成纖維細胞和瓊脂上形成克隆。
三、人黑色素瘤細胞株細胞培養(yǎng)步驟
1、人黑色素瘤細胞株培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基87%，
優(yōu)質(zhì)胎牛血清10%
GlutaMAX-1谷氨酰胺1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉1%
P/S青霉素-鏈霉素1%
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、人黑色素瘤細胞株細胞處理：
1）復(fù)蘇人黑色素瘤細胞株細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）人黑色素瘤細胞株細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁人黑色素瘤細胞株細胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人黑色素瘤細胞株細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
1、人黑色素瘤細胞株細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
人黑色素瘤細胞株可以用于EGCG和ECG基于PI3K/AKT/mTOR通路調(diào)節(jié)人黑色素瘤細胞的凋亡和自噬：
以4種兒茶素,表沒食子兒茶素3沒食子酸(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)、表兒茶素3沒食子酸(Epicatechin-3-Gallate,ECG)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、表兒茶素(Epicatechin,EC)為研究對象,結(jié)合惡性黑色素瘤模型,系統(tǒng)評估其通過凋亡和自噬機制調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞增殖的具體機制,為兒茶素治療黑色素瘤提供實驗依據(jù)和理論支持。
主要研究內(nèi)容如下：
(1)不同兒茶素對人黑色素瘤A375細胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示,4種兒茶素(EGCG、ECG、EGC、EC)里只有EGCG和ECG對人黑色素瘤A375細胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性。
(2)EGCG和ECG對人黑色素瘤A375細胞凋亡的作用。流式細胞儀實驗結(jié)果表明,與對照組相比,細胞經(jīng)過EGCG和ECG處理后凋亡比例增加。EGCG,ECG可誘導(dǎo)A375細胞周期阻滯在G0/G1期;同時,EGCG也可將A375細胞周期阻滯在S期,ECG也可將A375細胞周期阻滯在G2/M期。線粒體膜電位實驗表明,EGCG和ECG處理降低細胞內(nèi)線粒體膜電位。Western blotting實驗結(jié)果表明,EGCG和ECG處理細胞后,抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2基因(B Cell Lymphoma-2 Gene,Bcl-2)表達水平下調(diào),促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase,Caspase-3)的表達水平上調(diào),促進細胞凋亡。
(3)EGCG和ECG對人黑色素瘤A375細胞自噬的作用。RT-PCR和Western blotting實驗結(jié)果表明,在基因和蛋白水平上,EGCG和ECG降低沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Sirtuin3,Sirt3)和兩個自噬標志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated Protein1-Light Chain 3,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和自噬效應(yīng)蛋白-1(Beclin-1)的表達水平。此外,Western blotting實驗檢測得到,EGCG和ECG通過抑制腺苷酸激活蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Adenine Monophosphate-activated Protein Kinase/Mammalian Target of Rapamycin,AMPK/mTOR)和升高磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-Kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)通路相關(guān)蛋白的表達,從而發(fā)揮凋亡和自噬調(diào)節(jié)作用。
(4)加入自噬激活劑雷帕霉素檢測凋亡和自噬兩者的關(guān)系。結(jié)果顯示,與對照組相比,加入自噬激活劑雷帕霉素后,自噬標志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高,Caspase-3水平升高,Bcl-2水平下降,雷帕霉素誘導(dǎo)A375細胞發(fā)生凋亡和升高自噬。與單獨使用EGCG和ECG處理后相比,EGCG,ECG和雷帕霉素共處理后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達依舊顯著增加,但細胞凋亡的趨勢并沒有改變。說明對于人黑色素瘤A375細胞,細胞凋亡和自噬兩者是相互獨立的關(guān)系。
(5)EGCG對裸鼠惡性黑色素瘤的抑制作用。裸鼠腋下注射人源黑色素瘤細胞構(gòu)建異種黑色素瘤模型,在動物水平上評估EGCG通過凋亡和自噬對黑色素瘤的作用。實驗結(jié)果表明,與對照組相比,EGCG能夠抑制腫瘤體積的增大,上調(diào)總的Caspase-3以及或活化型Caspase-3的表達,下調(diào)Bcl-2的表達,誘導(dǎo)腫瘤組織凋亡;EGCG下調(diào)Beclin-1和LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達水平,從而下調(diào)腫瘤組織內(nèi)自噬水平。
綜上所述,兒茶素EGCG和ECG能夠抑制黑色素瘤細胞的增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡,降低細胞自噬水平,對黑色素瘤具有一定的治療作用。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！