一、背景
人白血病細(xì)胞是一種起始于血液形成組織的癌癥。白血病細(xì)胞是一種異常的白細(xì)胞，它不會(huì)在應(yīng)該死亡的時(shí)候死亡，反而會(huì)過度增殖，影響正常的血細(xì)胞，如白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。白血病主要分為急性白血病和慢性白血病兩大類，包括急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、急性粒細(xì)胞性白血病（AML）、慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–LL）以及慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）等。
人白血病細(xì)胞（NOMO-1 Cell）是從一名25歲的白人男性肺腺癌患者的胸水中分離建立的。該細(xì)胞具有淋巴母細(xì)胞樣的形態(tài)特征，并且能夠在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出懸浮生長(zhǎng)的特點(diǎn)。在科學(xué)研究領(lǐng)域，NOMO-1 Cell被廣泛應(yīng)用于白血病的研究、藥物篩選和毒性測(cè)試等方面。
二、人白血病細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、人白血病細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）人白血病細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、人白血病細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）NOMO-1人白血病細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人白血病細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人白血病細(xì)胞可以用于Venetoclax聯(lián)合地塞米松對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞的作用及初步機(jī)制研究：
探索BCL-2抑制劑Venetoclax聯(lián)合地塞米松在體外對(duì)急性髓系白血病(AML)細(xì)胞的抗腫瘤作用,以及減弱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)對(duì)AML細(xì)胞系的保護(hù)作用及其潛在的調(diào)控機(jī)制。
方法：Venetoclax和地塞米松單獨(dú)或聯(lián)合處理AML細(xì)胞系MOLM-13、NOMO1和THP-1,實(shí)驗(yàn)分組:未加藥的對(duì)照組、Venetoclax單藥組、地塞米松單藥組、Venetoclax和地塞米松聯(lián)合組;通過CCK-8檢測(cè)AML細(xì)胞的活力;通過Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)其凋亡;通過Western blot(WB)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP,BCL-2家族蛋白BCL-2、MCL-1和BCL-XL等蛋白的表達(dá)水平;qRT-PCR驗(yàn)證BCL-2家族BCL-2、MCL-1和BCL-XL等基因的表達(dá);使用Mitotracker Deep Red試劑對(duì)MSCs的線粒體進(jìn)行染色,然后將其與AML細(xì)胞共培養(yǎng),Venetoclax與地塞米松單獨(dú)或聯(lián)合作用于共培養(yǎng)體系,實(shí)驗(yàn)分組同上,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AML細(xì)胞的凋亡、線粒體膜電位(MMP)、活性氧(ROS)水平和線粒體熒光信號(hào)。
結(jié)果：地塞米松對(duì)AML細(xì)胞活力和凋亡沒有顯著影響。相對(duì)于Venetoclax單藥處理,地塞米松與Venetoclax聯(lián)合后,會(huì)增強(qiáng)Venetoclax的降低AML細(xì)胞活力的作用,引起更多的AML細(xì)胞凋亡。WB結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,地塞米松單獨(dú)使用會(huì)增加AML細(xì)胞中MCL-1蛋白的表達(dá),地塞米松與Venetoclax聯(lián)合作用,也增加了AML細(xì)胞中MCL-1蛋白的表達(dá)。AML細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)后,MSCs的存在減少了Venetoclax誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡,地塞米松聯(lián)合Venetoclax仍會(huì)增加Venetoclax誘導(dǎo)的凋亡。
共培養(yǎng)時(shí),Venetoclax會(huì)增加AML細(xì)胞中的ROS水平和MSCs向AML細(xì)胞轉(zhuǎn)移的線粒體,地塞米松會(huì)降低AML細(xì)胞中的ROS水平和MSCs向AML細(xì)胞轉(zhuǎn)移的線粒體,地塞米松聯(lián)合Venetoclax會(huì)降低AML細(xì)胞中Venetoclax誘導(dǎo)的ROS水平,使MSCs向AML細(xì)胞轉(zhuǎn)移的線粒體減少,這可能會(huì)導(dǎo)致MSCs對(duì)AML細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。
結(jié)論：地塞米松增強(qiáng)了Venetoclax在體外的抗腫瘤效果,Venetoclax聯(lián)合地塞米松會(huì)減少AML細(xì)胞中Venetoclax誘導(dǎo)的ROS水平,并減少M(fèi)SCs向AML細(xì)胞轉(zhuǎn)移的線粒體,這可能導(dǎo)致減弱MSCs對(duì)AML細(xì)胞的保護(hù)作用。
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