一、背景
人眼脈絡黑色素瘤細胞分離自脈絡膜黑色素瘤組織的貼壁多角形細胞樣細胞，STR檢測發(fā)現(xiàn)，三株人侵襲性脈絡膜黑色素瘤細胞C918、M619和Mum-2B為同一遺傳背景，懷疑存在交叉污染。
二、細胞培養(yǎng)操作步驟
1、人眼脈絡黑色素瘤細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）人眼脈絡黑色素瘤細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人眼脈絡黑色素瘤細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、人眼脈絡黑色素瘤細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）人眼脈絡黑色素瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）人眼脈絡黑色素瘤細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
下面T25瓶為例；
1、細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
三、應用
人眼脈絡黑色素瘤細胞可以用于Butein通過線粒體途徑誘導人葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡：
探索Butein的細胞毒作用，研究在體外對人類葡萄膜黑色素細胞瘤可能的防止及治療作用，并研究其對正常的人類鞏膜成纖維細胞及視網膜色素上皮細胞的作用。Butein誘導葡萄膜黑色素瘤細胞生物學改變，線粒體膜電位的變化后釋放細胞色素C，活化細胞凋亡蛋白酶9及3，通過這些研究闡明了Butein誘導黑色素細胞的信號通路。
1、方法三種人葡萄膜黑色素瘤細胞系(M17、SP6.5和人眼脈絡黑色素瘤細胞)，視網膜色素上皮細胞及鞏膜成纖維細胞與不同濃度的Butein培養(yǎng)，通過MTT評價Butein對細胞活力的影響，通過流式細胞儀分析細胞的凋亡，用JC-1酶標儀評價線粒體膜電位改變，酶聯(lián)免疫吸附試驗分析細胞凋亡蛋白3、8、9的改變。
2、結果Butein減少培養(yǎng)的人葡萄膜黑色素瘤的活性，呈劑量依賴效應(10、30、100μM)，SP6.5的半數(shù)抑制濃度IC50在13.3μM，M17在15.8μM，在轉移的惡性人眼脈絡黑色素瘤細胞有類似的劑量，為16.7μM，Butein在較低的濃度時選擇性的抑制葡萄膜黑色素細胞的活性，而對視網膜色素上皮細胞及成纖維細胞作用較小，Butein通過增加線粒體膜通透性及增加細胞色素C及凋亡蛋白9、3（不通過凋亡蛋白8）活性誘導腫瘤細胞凋亡。
3、結論30μM Butein誘導培養(yǎng)的人葡萄膜黑色素細胞凋亡，所以即使都是通過同一通路引起凋亡，人葡萄膜黑色素瘤與鼠皮膚黑色素瘤細胞相比前者對Butein更加敏感。
本研究表明100-300μM Butein可以殺傷3種人葡萄膜黑色素細胞瘤細胞(M17、SP6.5和C918)。人眼脈絡黑色素瘤細胞是轉移性細胞系，也可被Butein抑制，表明即使是高度侵入性的葡萄膜黑色素瘤細胞系也對Butein敏感。10μM及30μMButein對正常的視網膜色素上皮細胞及鞏膜成纖維細胞無影響，表明Butein對葡萄膜黑色素細胞的特殊抗腫瘤特性。用低濃度Butein培養(yǎng)細胞后，部分細胞被膜連蛋白染色，而不被EtD-III染色，提示存在早期的凋亡。用高濃度的Butein處理細胞后，大部分被膜連蛋白染色，一部分被EtD-III染色，提示凋亡已經處于晚期，細胞膜已經損壞。Butein損害了線粒體膜電位，增加了細胞色素C及凋亡蛋白酶9,3的表達，并呈劑量依賴性。而凋亡蛋白酶8沒有明顯改變。這表明Butein是通過線粒體途徑引起葡萄膜黑色素細胞瘤凋亡。
總之，低濃度的Butein可以誘導人葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡而對正常細胞影響較小，表明在體外Butein對人葡萄膜黑色素瘤是一個選擇性的有效的細胞凋亡藥物。因為轉移的黑色素瘤細胞對于傳統(tǒng)的化療藥物有很強的抗藥性，而Butein對轉移的人眼脈絡黑色素瘤細胞具有殺傷作用，所以Butein可能有望成為具有轉移的黑色素瘤細胞的治療及防治藥物，由于Butein的生物利用度及血漿濃度的研究剛剛起步，有必要進一步改變劑型及研究其與其他抗腫瘤藥物的相互作用。
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