一、背景及概述
志賀氏菌(Shigella)是目前致腸道感染的主要病原菌之一，屬于腸桿菌科的志賀氏菌(Shigella)屬，又稱痢疾桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，需氧或兼性厭氧。人類對(duì)痢疾桿菌有很高的易感性，幼兒可引起急性中毒，死亡率甚高。臨床上通常表現(xiàn)腹部痙攣痛、腹瀉和發(fā)熱，患者將不能從事飲食業(yè)、炊事及保育等工作。志賀氏菌在不衛(wèi)生和人口密集的條件下可迅速傳播，如餐廳、食堂。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球感染志賀氏菌的人數(shù)高達(dá)2 億，其中95％的致死病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。盡管我國(guó)尚未建立完善的食源性致病菌報(bào)告和檢測(cè)機(jī)制，每年僅記錄的志賀氏菌感染病例就高達(dá)40萬(wàn)，僅次于肝炎和結(jié)核。
二、制備方法
一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
將硝酸纖維素膜用志賀氏菌抗血清處理一次以上，晾干后再用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1％～1.5％的硫代硫酸鈉處理，晾干，得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜；將所述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜加入至 含志賀氏菌的懸浮液中，于36.8～37.2℃條件下放置30～35分鐘，得到含志賀氏菌的硝酸纖維素膜；將所述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜用磷酸緩沖液洗滌；將所述用磷酸鹽緩沖液洗滌后的硝酸纖維素膜涂板于培養(yǎng)基，在 36.8～37.2℃條件下培養(yǎng)18～24小時(shí)。
本發(fā)明志賀氏菌培養(yǎng)方法，通過(guò)使用含志賀氏菌抗血清和硫代硫 酸鈉的硝酸纖維素膜，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性，硝酸纖維素膜中 志賀氏菌抗血清與樣本中的志賀氏菌特異結(jié)合，硫代硫酸鈉能防止其 他的細(xì)菌在膜條上的生長(zhǎng)，通過(guò)洗滌將其他細(xì)菌洗脫，將吸附有較純濃度志賀氏菌的硝酸纖維素膜條接種于培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)，減少了其他細(xì)菌，特別是侵襲性大腸菌落對(duì)志賀氏菌菌落的影響，保證樣本中低濃度志賀氏菌不出現(xiàn)漏檢，從而提高志賀菌的檢出率。
三、檢測(cè)方法
（一）檢測(cè)試劑盒
CN201710552746提供一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用。
采用了如下的技術(shù)方案：一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)志賀氏菌，以志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)有一對(duì)引物和一條探針，其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：
上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'
下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'
探針：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1 -dT- GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。
本發(fā)明還提供一種用于志賀氏菌的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光RPA方法，所述檢測(cè)方法至少包括以下步驟：步驟1、從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；步驟2、采用上述用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒對(duì)步驟1所提取的所述DNA進(jìn)行等溫 擴(kuò)增反應(yīng)；其中，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度為37-39℃，時(shí)間為20-30min；步驟3、通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在志賀氏菌。本研究以志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因(ipaH)作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè) 計(jì)特異性引物及exo探針，建立了用于食品中志賀氏菌快速檢測(cè)的real-time RPA方法。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的用于志賀氏菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光RPA方法的建立，具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)操作簡(jiǎn)便，僅需增菌提取核酸后即可上機(jī)檢測(cè)，所有試劑均以凍干粉的形 式保存在反應(yīng)管中；
(2)反應(yīng)時(shí)間短，不需要熱變性，20min內(nèi)即可完成；
(3)反應(yīng)結(jié)果可直接 觀察，無(wú)需電泳檢測(cè)；
(4)便攜式熒光檢測(cè)設(shè)備的使用。
本方法中使用的Genie III等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)緊湊小巧，輕便耐用，僅為1.75kg左右，觸摸屏操作，無(wú)需連接電腦，其內(nèi)置長(zhǎng)航時(shí)鋰電池，可在無(wú)電源環(huán)境中全天戶外工作，可用于微生物性食品中毒事件原因的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供所述的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法在志賀氏菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究中運(yùn)用建立的real-time RPA方法，對(duì)人工污染志賀氏菌的不同樣品進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品污染量為46CFU/25g、增菌6h時(shí)，雞肉中可檢出志賀氏菌。
（二）快速檢測(cè)
一種快速檢測(cè)志賀氏菌的方法，包括以下步驟：
1)納米微球的制備：
a.添加0.4-0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2·4H2O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0-120℃，然后將3-7mL 25％的NH3·H2O添加到混合液中， 反應(yīng)2h；用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3～5次，得Fe3O4納米粒子；
b.取12mg Fe3O4納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢 攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液 中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子；
c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL無(wú)水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的 啡啰啉聯(lián)釕(Ru(bqy)32+)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后 加入600-900μL的NH4OH，劇烈攪拌3h，得到Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備 用；
d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的 Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球；
e.將硅烷化的Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷 基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過(guò)硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70 ℃，200r/min下攪拌，反應(yīng)5h后得羧基化的Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球；
2)取0.5-2mg羧基化的Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球加入1mL偶聯(lián)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至 5-10，加入0.05-0.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽
(EDC)活化羧基，及100-400μg抗志賀氏菌單抗，在溫度37℃時(shí)，放在10-15rpm的旋轉(zhuǎn)儀上偶聯(lián)60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取1mL封閉劑與納米微球混合封閉0.5-1h，得到Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球-單抗；
所述偶聯(lián)緩沖液配制方法如下：將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸 混合后，稀釋10倍體積；
所述清洗緩沖液配制方法如下：稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL 的無(wú)菌蒸餾水中，調(diào)pH為5.5-6.0；
所述封閉劑配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸鹽(PBS)緩沖 液配成封閉劑；
3)培養(yǎng)志賀氏菌，將菌液調(diào)整濃度為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/ mL，各取1mL備用；取待測(cè)樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與100-150μg Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球-單抗，于溫度37℃，旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3- 5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復(fù)溶于PBS中得Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌；
4)免疫層析試紙條的制備：將樣本墊用pH 8.50.1M Tris-HCl緩沖液(1％BSA， 0.5％Tween-20)浸泡處理，置于60℃鼓風(fēng)干燥箱，2h后取出備用；將志賀氏菌兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，濃度均為1-2mg/mL，噴量 均為0.75uL/cm，37℃真空干燥過(guò)夜取出置于干燥缸中備用；將過(guò)濾墊、樣本墊、硝酸纖維 膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡；將制備好的試紙 條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存?zhèn)溆茫?br />
5)試紙條對(duì)樣品的檢測(cè)：將收集到的Fe3O4/ Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌稀釋到 50-150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強(qiáng)度和T/C的值；
6)定性分析：用肉眼觀察結(jié)果進(jìn)行定性分析，T線顯色則說(shuō)明樣品中有志賀氏菌，T線不顯色則說(shuō)明樣品中沒(méi)有志賀氏菌或是含有志賀氏菌的量低于103CFU/mL；
7)定量分析：使用熒光讀取儀測(cè)量T線、C線的熒光強(qiáng)度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標(biāo)，T/C值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定普通樣品中的志賀氏菌數(shù)量。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買(mǎi)等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來(lái)詢！