一、背景
人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞該細(xì)胞源自一位14歲患有T淋巴細(xì)胞白血病男性的外周血。
急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病。異常增生的原始細(xì)胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同時也可侵及骨髓外的組織，如腦膜、淋巴結(jié)、性腺、肝等。我國曾進(jìn)行過白血病發(fā)病情況調(diào)查，ALL發(fā)病率約為0.67/10萬。在油田、污染區(qū)發(fā)病率明顯高于全國發(fā)病率。ALL兒童期（0～9歲）為發(fā)病高峰，可占兒童白血病的70%以上。ALL在成人中占成人白血病的20%左右。依據(jù)ALL不同的生物學(xué)特性制定相應(yīng)的治療方案已取得較好療效，大約80%的兒童和30%的成人能夠獲得長期無病生存，并且有治愈的可能。
二、人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中，加入約6ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1、對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入細(xì)胞庫推薦的無血清凍存液。
三、應(yīng)用
人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞可以用于FTO促急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長的研究：
N6甲基腺苷(m6A)修飾是mRNA內(nèi)部豐度最高的修飾,其動態(tài)修飾過程和生物學(xué)功能由甲基轉(zhuǎn)移酶(writer)、去甲基酶(eraser)和識別蛋白(reader)共同調(diào)控。FTO(Fat mass and obesity-associated protein)是m6A修飾的主要去甲基酶,具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能,且已有多種研發(fā)成功的小分子抑制劑。然而,FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)細(xì)胞中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本論文旨在研究FTO在T-ALL細(xì)胞中的表達(dá)和功能、解析FTO的作用機(jī)制,并評價FTO小分子抑制劑的抗T-ALL效能。
方法：
(1)通過RT-qPCR檢測FTO在T-ALL細(xì)胞與正常對照細(xì)胞中的表達(dá);在T-ALL細(xì)胞中沉默和過表達(dá)FTO,并檢測細(xì)胞的m6A修飾水平、生長和集落生成等;檢測沉默F(xiàn)TO對細(xì)胞凋亡及Jurkat細(xì)胞在免疫缺陷(NSG)小鼠中誘發(fā)白血病的能力;檢測沉默F(xiàn)TO對T-ALL患者來源細(xì)胞和正常造血細(xì)胞增殖的影響。
(2)RNA-seq篩選T-ALL細(xì)胞中受FTO表達(dá)影響的差異表達(dá)基因,并使用RT-qPCR驗(yàn)證;通過放線菌素D(ActD)和RNA甲基化免疫共沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)等實(shí)驗(yàn)篩選FTO的下游靶基因;在單獨(dú)沉默RAB7A(RAS-related GTP-binding proteins)后,檢測細(xì)胞生長、集落生成和細(xì)胞凋亡等;在沉默F(xiàn)TO細(xì)胞中過表達(dá)RAB7A,通過RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecitation,RIP)研究YTHDF2(YTH domain family 2,m6A識別蛋白)與RAB7A mRNA之間的相互作用;使用精胺普魯蘭遞送的方法,在沉默F(xiàn)TO的細(xì)胞中沉默YTHDF2,檢測細(xì)胞的生長、集落生成和RAB7A表達(dá)等。
(3)檢測FTO的抑制劑(FB23-2)對T-ALL細(xì)胞的活性、集落生成、細(xì)胞凋亡和白血病生成能力的影響;并檢測FB23-2對T-ALL患者來源細(xì)胞和正常造血細(xì)胞增殖的影響。
結(jié)果：
(1)FTO在T-ALL細(xì)胞較正常造血細(xì)胞中異常高表達(dá);FTO調(diào)控T-ALL細(xì)胞的m6A修飾水平,FTO促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的體外生長及集落生成能力;沉默F(xiàn)TO促進(jìn)細(xì)胞凋亡、顯著減弱Jurkat細(xì)胞在NSG小鼠中的成白血病能力；
(2)RNA-seq和驗(yàn)證顯示FTO在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RAB7A的表達(dá),沉默F(xiàn)TO增強(qiáng)RAB7A mRNA上的m6A修飾;沉默RAB7A顯著抑制T-ALL細(xì)胞的生長和集落生成能力,并誘發(fā)細(xì)胞凋亡;過表達(dá)RAB7A能部分“挽救”沉默F(xiàn)TO導(dǎo)致的生長抑制和凋亡增高;YTHDF2能在沉默F(xiàn)TO細(xì)胞中較對照細(xì)胞更強(qiáng)地結(jié)合RAB7A mRNA,沉默YTHDF2部分“挽救”沉默F(xiàn)TO導(dǎo)致的生長抑制與RAB7A表達(dá)受抑。
(3)FB23-2有效抑制T-ALL細(xì)胞的活性,集落生成能力,并誘發(fā)凋亡,但對正常造血細(xì)胞影響較小;FB23-2也顯著減弱Jurkat細(xì)胞的白血病生成能力。結(jié)論:FTO在T-ALL細(xì)胞中異常高表達(dá),通過抑制RAB7A的m6A/YTHDF2依賴性降解而穩(wěn)定其表達(dá);FTO/m6A/RAB7A通路促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的生長與生存;FTO的小分子抑制劑具有一定的抗T-ALL效能。
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