一、背景
大鼠骨髓單核細(xì)胞是從大鼠骨髓中分離出來(lái)的一種骨髓單個(gè)核細(xì)胞。骨髓單個(gè)核細(xì)胞是骨髓中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些細(xì)胞在機(jī)體防御系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)中起著重要的作用。在分離這些細(xì)胞時(shí)，通常采用密度梯度離心法，將一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，進(jìn)而將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離。
大鼠骨髓單核細(xì)胞是一種存在于大鼠骨髓中的細(xì)胞類型，也稱為骨髓單核細(xì)胞系。這些細(xì)胞是一種多能性干細(xì)胞，可以分化為多種類型的細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞等。
骨髓單核細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。它們可以吞噬和消化細(xì)菌、病毒和其他微生物，從而保護(hù)機(jī)體免受感染。此外，骨髓單核細(xì)胞還可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。
在醫(yī)學(xué)研究中，大鼠骨髓單核細(xì)胞被廣泛用于研究免疫系統(tǒng)的功能和疾病機(jī)制。例如，通過(guò)將特定的基因?qū)氪笫蠊撬鑶魏思?xì)胞中，可以研究這些基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)的影響。此外，由于大鼠和人類的免疫系統(tǒng)存在一定的相似性，因此大鼠骨髓單核細(xì)胞也被用于研究人類免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。
二、大鼠骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇大鼠骨髓單核細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)大鼠骨髓單核細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)大鼠骨髓單核細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
大鼠骨髓單核細(xì)胞可以用于Escherichia coli脂多糖對(duì)牙周靶細(xì)胞—成骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究：
探討了Escherichia coli LPS對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞的影響及其可能的作用機(jī)理和藥物干預(yù)機(jī)制。
建立LPS誘導(dǎo)骨吸收模型，探討了LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收作用。結(jié)果顯示LPS能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成、骨吸收并激活A(yù)kt而導(dǎo)致p-AktSer473和p-AktThr308水平明顯增加。而且PI3K的另一抑制劑Wortmanin可顯著抑制破骨細(xì)胞形成和Akt的活化，并誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞凋亡，表明LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、吸收和存活可能與PI3K／Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。此外，本研究還探討了葛根提取物-葛根素對(duì)骨形成和骨吸收的干預(yù)作用。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素可明顯促進(jìn)骨形成并誘導(dǎo)Akt活化和核轉(zhuǎn)位，且這種活化作用能被LY294002所阻斷。同時(shí)，葛根素還可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的骨吸收和Akt活化，并促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞-大鼠骨髓單核細(xì)胞凋亡。由此可知，葛根素可促進(jìn)骨形成和抑制LPS誘導(dǎo)骨吸收，其機(jī)理可能與PI3K／Akt通路激活或滅活相關(guān)。
綜上所述，本研究主要?jiǎng)?chuàng)新體現(xiàn)在：
1、本研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡模型，論證了E．coli-LPS可抑制牙周靶細(xì)胞-成骨細(xì)胞增殖與分化而影響牙槽骨形成。
2、利用LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收證實(shí)了E．coli-LPS可刺激牙周另一靶細(xì)胞-大鼠骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，并促進(jìn)骨吸收，提示刺激大鼠骨髓單核細(xì)胞的分化、融合可誘導(dǎo)或加重牙槽骨吸收。
3、本研究通過(guò)對(duì)PI3K／Akt通路在E．coli-LPS誘導(dǎo)牙周靶細(xì)胞凋亡和骨吸收模型中的作用研究，為深入探討LPS誘導(dǎo)的牙槽骨吸收和牙周炎發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新的信號(hào)通路，并為研制開(kāi)發(fā)治療該病藥物提供新的作用靶點(diǎn)和一定的理論基礎(chǔ)。
4、本研究還證實(shí)了葛根素可促進(jìn)骨形成和抑制E．coli-LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨吸收，因此葛根素可用于預(yù)防和輔助治療LPS感染的牙周病，并為該藥在牙周疾病上的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。
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