一、背景
大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞是一種常用的實驗細胞，用于研究視網(wǎng)膜色素上皮細胞具有支持、營養(yǎng)光感受器細胞、遮光、散熱以及再生和修復等作用。胞的生理和病理過程。這些細胞具有支持、營養(yǎng)光感受器細胞、遮光、散熱以及再生和修復等作用。
在組織學上，視網(wǎng)膜分為10層，由外向內(nèi)分別是：色素上皮層、視桿細胞層、視錐細胞層、外界膜、外核層、內(nèi)界膜、內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜。其中，色素上皮層與脈絡膜緊密相連，由色素上皮細胞組成。
RPEC大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞通常以T25培養(yǎng)瓶包裝，容積75ml細胞數(shù)量可達10的6次方左右。這些細胞生長特性良好，活性高，存活率高，質(zhì)量保證，沒有細菌、真菌、支原體等微生物污染。
二、大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)操作
1)復蘇大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞可以用于八肽膽囊收縮素對高糖所致大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞損傷的干預作用：
應用不同濃度的八肽膽囊收縮素（Cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作用于高糖培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞，培養(yǎng)48小時后，MTT法檢測細胞活力以及NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、及IL-6的表達的變化，根據(jù)結(jié)果篩選出CCK-8合適的治療濃度，觀察此濃度作用RPE細胞24小時、48小時及72小時上述因子的表達變化。
方法：
1、篩選CCK-8治療濃度：培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，隨機分為8組：①正常對照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L）②高糖組（葡萄糖濃度：30mmol/L）③高滲對照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L）④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-5mmol/L）⑤高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-6mmol/L）⑥高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-7mmol/L）⑦高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-8mmol/L）⑧高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-9mmol/L），各組細胞應用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后換成條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，倒置顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞形態(tài)，應用MTT法檢測不同濃度CCK-8對大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞活力的影響，同時收集細胞標本，進行RT-PCR實驗，檢測NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6表達的變化。
2、不同時間段CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化：根據(jù)MTT及RT-PCR的結(jié)果得出CCK-8的治療濃度為10-6mmol/L，再次分組：①正常對照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L）②高糖組(葡萄糖濃度：30mmol/L)③高滲對照組(葡萄糖濃度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L)④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-6mmol/L），各組細胞分別培養(yǎng)24小時、48小時、72小時，取相應時間段細胞標本進行RT-PCR檢測上述7種因子表達。
結(jié)果：
1、MTT法檢測結(jié)果：與正常對照組比較，高糖組大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞的活力明顯降低（P<0.05），高滲對照組細胞活力未見明顯改變；各不同濃度治療組的細胞活力低于正常對照組，具有明顯差異（P<0.05），CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三組之間細胞活力無明顯差異，三組與高糖組相比無明顯差異，CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間細胞活力無明顯差異，但要高于其他三組治療組和高糖組（P<0.05）。
2、篩選CCK-8治療濃度階段RT-PCR結(jié)果：與正常對照組比較，高糖組NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6的表達上升（P<0.05），高滲對照組的表達未見明顯差異。各不同濃度治療組與正常對照組相比，其中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達明顯上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達明顯下降（P<0.05）。與高糖組相比，CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三組中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達下降（P<0.05），但是三組之間未見明顯差異。CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間未見明顯差異，但與其他三組治療組及高糖組相比，NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達明顯上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達明顯下降（P<0.05）。
3、不同時間段CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化：與正常對照組相比，高滲對照組7因子的表達未見明顯差異；高糖組與正常對照組及高滲對照組相比，上述7種因子的表達明顯上升（P<0.05）；與高糖組相比，治療組NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1表達明顯上升（P<0.05），48小時高于24小時及72小時（P<0.05），24小時及72小時之間無明顯差異；與高糖組相比，治療組TNF-α、IL-1α及IL-6表達下降（P<0.05），72小時的表達低于24小時和48小時（P<0.05），24小時和48小時間的表達無明顯差異。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務,是中國微生物菌種保藏中心的服務平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設設備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！