一、背景
201T人肺腺癌細(xì)胞系是一種來源于人類肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系通常用于研究肺腺癌的生物學(xué)特性、藥物篩選和治療方案開發(fā)等方面。
二、201T細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)
來源：201T細(xì)胞系來源于一名55歲男性肺腺癌患者的腫瘤組織。
形態(tài)特征：201T細(xì)胞呈多邊形或長(zhǎng)方形，具有多核和核分裂像。
生長(zhǎng)特性：201T細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)迅速，具有良好的增殖能力。
分子特征：201T細(xì)胞表達(dá)多種肺腺癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，如EGFR、KRAS等。
藥物敏感性：201T細(xì)胞對(duì)多種化療藥物具有敏感性，如紫杉醇、順鉑等。
基因突變：201T細(xì)胞中存在多個(gè)與肺腺癌發(fā)生相關(guān)的基因突變，如EGFR、KRAS等。
201T人肺腺癌細(xì)胞系為肺腺癌的研究提供了一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有助于深入了解該疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療方法和藥物篩選。
三、201T人肺腺癌細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇201T人肺腺癌細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)201T人肺腺癌細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)201T人肺腺癌細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
201T人肺腺癌細(xì)胞系可以用于GRK6基因在肺腺癌中的作用及機(jī)制研究：
人肺腺癌中GRK6基因的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,闡明GRK6在肺腺癌中表達(dá)下調(diào)的可能原因以及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa對(duì)其相關(guān)調(diào)控機(jī)制,探討C/EBPa/GRK6信號(hào)通路在肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用。
研究方法：
1、用免疫組化法測(cè)定包含122例肺腺癌和45例正常肺組織的組織芯片GRK6基因蛋白表達(dá),蛋白免疫印跡檢測(cè)18例新鮮肺腺癌組織標(biāo)本和鄰近的非癌肺組織標(biāo)本的蛋白表達(dá),qPCR測(cè)定20例新鮮肺腺癌患者癌組織中及匹配的鄰近的非癌肺組織標(biāo)本中GRK6基因的mRNA。統(tǒng)計(jì)分析GRK6蛋白表達(dá)水平與相關(guān)臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系;
2、應(yīng)用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR檢測(cè)54例肺腺癌臨床標(biāo)本中GRK6基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),分析GRK6基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,并應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、A427、201T人肺腺癌細(xì)胞系、H1299和支氣管細(xì)胞系16HBE中GRK6基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),進(jìn)一步應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理肺癌細(xì)胞后觀察GRK6基因表達(dá)水平的變化;
3、應(yīng)用生物信息學(xué)及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)探索并驗(yàn)證可能參與調(diào)控GRK6基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa,利用野生型和突變型的GRK6啟動(dòng)子構(gòu)建重組質(zhì)粒,并進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)以研究C/EBPa與GRK6可能的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)GRK6基因轉(zhuǎn)錄的影響。利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)肺腺癌組織和鄰近的非癌肺組織中C/EBPa和GRK6基因啟動(dòng)子之間的結(jié)合情況。對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549應(yīng)用5-氮雜-2’-脫氧胞苷進(jìn)行去甲基化處理,染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)C/EBPa和GRK6基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合變化情況;4、通過沉默及過表達(dá)C/EBPa觀察GRK6的表達(dá),通過沉默及過表達(dá)GRK6觀察肺腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的變化,調(diào)控肺癌細(xì)胞A549、201T人肺腺癌細(xì)胞系及H1299的GRK6表達(dá)水平觀察EMT相關(guān)標(biāo)記物E-鈣黏蛋白和波形蛋白水平的變化,過表達(dá)肺癌細(xì)胞A549的GRK6水平,觀察MMP2、MMP7水平的變化。
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