一、背景
人結(jié)腸腺癌細(xì)胞是LS 180(ATCC CL 187)結(jié)腸腺癌細(xì)胞株的胰蛋白酶化變種。它比親本更易傳代，和LS 180一樣生成大量的癌胚抗原(CEA)。電鏡研究表明有豐富的微絲和細(xì)胞質(zhì)粘液素液泡。直腸抗原3陽(yáng)性。p53抗原表達(dá)陰性，但mRNA表達(dá)陽(yáng)性。與ATCC CL-187來源于同一個(gè)腫瘤。LS 174T細(xì)胞角蛋白染色陽(yáng)性。癌基因c-myc,N-myc,H-ras,N-ras,Myb,和fos的表達(dá)呈陽(yáng)性。癌基因k-ras和sis的表達(dá)未做檢測(cè)。
二、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1)準(zhǔn)備：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
2、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）人結(jié)腸腺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物（mingzhoubio）按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人結(jié)腸腺癌細(xì)胞可以用于MiR-492調(diào)控CD147表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T奧沙利鉑耐藥性的影響的研究：
研究建立了奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌S174T/L-OHP細(xì)胞系,運(yùn)用該細(xì)胞系開展體外實(shí)驗(yàn),可以簡(jiǎn)化并很好的模擬結(jié)腸癌對(duì)奧沙利鉑耐藥的發(fā)展。利用此細(xì)胞系深入研究耐藥的分子機(jī)制,可能有助于發(fā)展有效治療方式,將耐藥腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為對(duì)化療敏感的細(xì)胞。進(jìn)而發(fā)展新型靶向治療,攻克腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥的問題,這也正是目前結(jié)腸癌治療的一個(gè)熱點(diǎn)。
研究通過開展體內(nèi)外細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),旨在闡明miR-492/CD 147軸在結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的關(guān)鍵功能調(diào)控作用。研究結(jié)果提示miR-492通過調(diào)節(jié)CD147,促進(jìn)結(jié)腸癌對(duì)奧沙利鉑的耐藥。CD147可能成為對(duì)抗結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的一個(gè)新型治療靶點(diǎn)。
方法：
1、建立LS174T/L-OHP寸藥細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)所采用的方法是逐步遞增培養(yǎng)液中L-OHP濃度、間歇作用于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)篩選而獲得。應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)倍比稀釋濃度的L-OHP對(duì)其細(xì)胞的抑制率,進(jìn)而確認(rèn)所建立細(xì)胞系具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性。
2、分析Mi R-492/CD147在結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T及耐藥細(xì)胞LS 174T/L-OHP中的表達(dá)實(shí)時(shí)PCR分析LS 174T/L-OHP和LS174T細(xì)胞內(nèi)miR-492和CD147的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)LS 174T/L-OHP和人結(jié)腸腺癌細(xì)胞中CD147的表達(dá)水平。揭示miR-492/CD147可能參與人結(jié)腸腺癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑耐藥的過程。
3、敲低LS 174T/L-OHP細(xì)胞CD147表達(dá)對(duì)LS 174T/LOHP細(xì)胞耐藥性的影響RNA干擾技術(shù)敲低LS 174T/L-OHP細(xì)胞CD147表達(dá)后,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)LS 174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性的影響。
4、下調(diào)LS 174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平的影響采用miRNA抑制體轉(zhuǎn)染LS 174T/L-OHP細(xì)胞的方法,下調(diào)LS 174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492的表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平的影響。
5、上調(diào)LS 174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平的影響轉(zhuǎn)染pre-mi R-492外源性上調(diào)miR-492,檢測(cè)LS174T/L-OHP細(xì)胞中CD147蛋白含量,雙熒光素酶檢測(cè)CD147 3’-UTR的啟動(dòng)子熒光素酶活性,進(jìn)而MTT法檢測(cè)LS 174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性。
6、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用裸鼠腫瘤耐藥細(xì)胞,外源性上調(diào)miR-492,檢測(cè)其對(duì)CD147的調(diào)控作用,同時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤體積來揭示miR-492/CD147對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。
結(jié)果：在本研究中,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞相比,奧沙利鉑耐藥細(xì)胞LS 174T/L-OHP中miR-492的表達(dá)水平較低,CD147的表達(dá)水平則更高。在LS 174T-L-OHP中,我們還發(fā)現(xiàn)敲低CD147可以增強(qiáng)LS 174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。
采用miRNA抑制體轉(zhuǎn)染LS 174T/L-OHP細(xì)胞的方法,下調(diào)LS 174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492的表達(dá),CD147表達(dá)水平升高；外源性導(dǎo)入pre-miR-492上調(diào)miR-492,可以下調(diào)CD147的表達(dá)水平,同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。此外,給奧沙利鉑耐藥移植瘤注入miR-492,能夠提高耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的響應(yīng)。
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