一、背景
人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞來(lái)源于39歲患有子宮內(nèi)膜腺癌的女性，表達(dá)ER、PR。有報(bào)道稱該細(xì)胞可產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，胎盤(pán)堿性磷酸酶、絨膜促性腺激素。
二、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考
1、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺(tái)中，化凍的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對(duì)貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞傳代
1）待人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)到80%-90%匯合度時(shí)，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無(wú)菌PBS潤(rùn)洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時(shí)間不同），取出人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞脫落下來(lái)成單個(gè)細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無(wú)菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度調(diào)整比例），分別加入到2個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凍存
1）按照人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺(tái)內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計(jì)數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無(wú)血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個(gè)/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存
三、應(yīng)用
人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞可以用于姜黃素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（HEC-1-B）凋亡及其機(jī)制的研究：
觀察姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1-B)體外增殖及相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響,探討姜黃素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
方法：將體外養(yǎng)殖的HEC-1-B細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)的抽樣分組,分別為對(duì)照組、姜黃素Ⅰ、姜黃素Ⅱ、姜黃素Ⅲ和姜黃素Ⅳ組共五個(gè)小組。分別給與不同濃度的姜黃素(0,10,20,40,80)μmol/L培養(yǎng)48h和72h。
采用MTT法：1.檢測(cè)人HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率2.Hoechest33258熒光染色觀察人HEC-1-B田胞核形態(tài)的變化3.Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果：1、姜黃素對(duì)HEC-]-B增殖和凋亡的影響
(1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將所有的小組進(jìn)行觀察對(duì)比分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素每個(gè)小組吸光度都比對(duì)照小組低,(P<0.01),同時(shí)發(fā)現(xiàn)用藥組的濃度在(10～80)μmol/L區(qū)間里對(duì)劑量具有很強(qiáng)的依賴性,這就反映了姜黃素有阻礙HEC-1-B細(xì)胞發(fā)展的作用。
(2) Hoechest33258熒光染色觀察顯示,對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,而姜黃素各組細(xì)胞呈核碎裂、核固縮、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等凋亡特征。提示姜黃素可誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌(HEC-1-B)細(xì)胞凋亡。
2、姜黃素對(duì)HEG-1-B細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,不同濃度的姜黃素作用48h和72h之后,和對(duì)比組進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果HEC-1-B細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)在這段時(shí)間里呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),它是伴隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的上升而表達(dá)減少(P<0.01),而且具有時(shí)間-劑量依賴性。Western blot檢測(cè)caspase-3蛋白,與對(duì)比組進(jìn)行對(duì)照,不同濃度的姜黃素作用48h和72h后,HEC-1-B細(xì)胞的caspase-3蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組有不同程度的升高,并隨姜黃素濃度及作用的時(shí)間的增加而遞增,呈時(shí)間-劑量依賴性(P<0.01)。
結(jié)論：姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人HEC-1-B細(xì)胞具有抑制作用,且這種抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈時(shí)間-劑量依賴方式。一定條件下,可抑制人HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng),且誘導(dǎo)其凋亡,其機(jī)制可能是下調(diào)HEC-1-B細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá),直接激活caspase-3蛋白而誘導(dǎo)人HEC-1-B細(xì)胞凋亡。
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