HFF人正常皮膚細胞系的應用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-01-05 09:11:00
一、背景
HFF人正常皮膚細胞系是一種常用的實驗細胞系，用于研究人皮膚細胞的生理和病理過程。這種細胞系由人正常皮膚細胞培養(yǎng)而來，具有上皮細胞樣的形態(tài)和生物學特性。
HFF人正常皮膚細胞系通常用于各種生物學實驗，如細胞增殖、細胞凋亡、細胞信號轉(zhuǎn)導、基因表達等。這些實驗的結(jié)果可以用于研究各種皮膚疾病的病因和病理機制，以及開發(fā)新的治療策略。
在使用HFF人正常皮膚細胞系進行實驗時，需要注意細胞的保存和運輸，以及細胞的生長特性和質(zhì)量控制。同時，還需要根據(jù)具體的實驗目的和要求，選擇合適的實驗方法和試劑，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。
1)復蘇HFF人正常皮膚細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)HFF人正常皮膚細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)HFF人正常皮膚細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
HFF人正常皮膚細胞系可以用于絲裂霉素對體外培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細胞及Hacat細胞的作用及機制研究：
探討不同濃度的絲裂霉素對體外培養(yǎng)的HFF人正常皮膚細胞系及HaCat細胞形態(tài)、細胞增殖、生長特性及細胞凋亡等方面的影響,從而選取適當?shù)淖饔脻舛?研究該濃度的絲裂霉素作用于皮膚成纖維細胞后,細胞內(nèi)caspase-3和caspase-8的表達,初步探討絲裂霉素的凋亡誘導機制,以及成纖維細胞內(nèi)細胞因子TGF-β1、bFGF與Ⅰ、Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達變化,為局部應用絲裂霉素預防和治療耳鼻咽喉術(shù)后皮膚纖維增生及瘢痕形成提供理論依據(jù)。
方法：體外培養(yǎng)HFF人正常皮膚細胞系及HaCat細胞,以0.04mg/ml、0.4mg/ml濃度的絲裂霉素及無血清培養(yǎng)基對照分別作用于這兩種細胞5min,培養(yǎng)不同時程后采用倒置顯微鏡、細胞計數(shù)及MTT檢測法觀察兩種細胞形態(tài)、增殖、生長特性與增殖抑制情況;采用AO/PI染色觀察計數(shù)成纖維細胞的凋亡率;通過western blot法檢測caspase-3的表達,免疫熒光法檢測細胞內(nèi)caspase-8活化及TGF-β1的表達;RT-PCR法檢測細胞內(nèi)TGF-β1、bFGF、Ⅰ型及Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達情況。采用IPP圖像分析軟件和spssv15.0統(tǒng)計軟件進行圖片分析與統(tǒng)計學處理。
結(jié)果：HFF人正常皮膚細胞系及HaCat細胞呈指數(shù)生長;0.04mg/ml及0.4mg/ml濃度的絲裂霉素作用5min后能有效抑制HFF人正常皮膚細胞系及HaCat細胞的增殖,并使細胞增大變形、細胞間形態(tài)差異較大。0.04mg/ml濃度的絲裂霉素作用后第5天成纖維細胞呈現(xiàn)小幅增殖,對成纖維細胞的抑制強度明顯低于0.4mg/ml濃度的絲裂霉素;兩種試驗濃度的絲裂霉素所致成纖維細胞的死亡形式主要為凋亡,0.4mg/ml濃度的絲裂霉素促凋亡作用明顯強于0.04mg/ml濃度的絲裂霉素,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。0.4mg/ml濃度的絲裂霉素作用后前caspase-3表達先升高后降低,免疫熒光法檢測到隨培養(yǎng)時間的延長caspase-8活化片段的熒光強度逐漸增強,提示caspase-8的活化增多;0.4mg/ml濃度的絲裂霉素作用后,免疫熒光法檢測細胞內(nèi)TGF-β1蛋白表達變化不明顯,但細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA卻隨培養(yǎng)時間的延長表達逐漸減少,bFGF mRNA的表達逐漸增高,Ⅰ型、Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達量則明顯下降。
結(jié)論：0.04mg/ml和0.4mg/ml濃度的絲裂霉素能有效的抑制HFF人正常皮膚細胞系增殖,以0.4mg/ml濃度的絲裂霉素抑制作用較持久;絲裂霉素可以通過啟動caspase凋亡途徑,增加細胞凋亡;實驗濃度的絲裂霉素可以從mRNA水平調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、bFGF以及Ⅰ型、Ⅲ型前膠原蛋白的表達,從而減少細胞外機基質(zhì)的合成,有效的抑制纖維增生瘢痕形成。但與此同時,絲裂霉素對HaCat細胞也有較強的增殖抑制作用,提示臨床局部應用絲裂霉素預防和治療耳鼻咽喉術(shù)后皮膚纖維增生及瘢痕形成時應注意保護表皮細胞,避免其毒副作用的影響。
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