人結(jié)直腸癌細(xì)胞DiFi的培養(yǎng)步驟與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2024-01-15 09:52:42
一、細(xì)胞簡(jiǎn)介
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細(xì)胞信息：DiFi
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶x1；1.5ml凍存管x2
細(xì)胞數(shù)量：1x10^6；1x10^6
保存溫度：37℃；-198℃
運(yùn)輸方式：常溫保溫運(yùn)輸；干冰運(yùn)輸
安全等級(jí)：1
用途限制：僅供科研3類(lèi)
培養(yǎng)體系：DMEM高糖（HYCLONE SH30022.01）+10%FBS+1%三抗
培養(yǎng)溫度：37℃
二氧化碳濃度：5%
細(xì)胞用途：僅供科研使用。
用途：細(xì)胞系
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類(lèi)或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）
1）來(lái)源：DiFi人結(jié)直腸癌細(xì)胞
2）含量：>1x106 個(gè)/mL
3）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5）培養(yǎng)基：DMEM-H:Dulbecco＇sModifiedEagle＇sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS
6）生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)
三、細(xì)胞的運(yùn)輸和保存
使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml凍存管發(fā)送存活細(xì)胞。收到細(xì)胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min后，于潔凈操作臺(tái)棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿或者T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基( GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉 0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）DiFi人結(jié)直腸癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
1.收到細(xì)胞后首先觀(guān)察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。
2.先不開(kāi)瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(shí)（4h左右），穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，切忌在溫箱內(nèi)靜置過(guò)夜。
3.靜置后鏡檢，拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
4. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞瓶?jī)?nèi)液體都轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管內(nèi)，1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，培養(yǎng)基上清可備用，管底細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重懸。鏡檢時(shí)若細(xì)胞密度超過(guò)80%，可將細(xì)胞懸液分至2個(gè)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)；若密度未超過(guò)80%，細(xì)胞懸液移至原瓶繼續(xù)培養(yǎng)，待達(dá)到80%時(shí)再正常傳代。備注：聚團(tuán)生長(zhǎng)慢，有密度依賴(lài)，必須使用T25培養(yǎng)瓶豎立培養(yǎng)，3天一次半量換液一次，1-2周傳代一次。
貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞密度超過(guò)80%，可正常傳代；若未超過(guò)80%，收集細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。備注：細(xì)胞貼壁慢，傳代后細(xì)胞放2天不動(dòng)。
5.細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗，可收集后4℃保存?zhèn)溆?，可補(bǔ)加2%血清。剛開(kāi)始傳代時(shí)建議一半用細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，一半用客戶(hù)自備的培養(yǎng)基，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，以免因不適應(yīng)而造成生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。
6.因?yàn)镈iFi人結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程外因太多，所以我們的售后保障期為一周，超過(guò)一周的細(xì)胞我們會(huì)酌情處理，但不提供免費(fèi)更換服務(wù)。
六、復(fù)蘇細(xì)胞收貨注意事項(xiàng)
收到細(xì)胞后，靜置 3 小時(shí)，然后當(dāng)天更換新鮮培養(yǎng)基！原瓶培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用！該細(xì)胞訂單用戶(hù)訂購(gòu)前，需核實(shí)確認(rèn)。
培養(yǎng)基貨號(hào) DMEM(HYCLONE SH30022.01 或 GIBCO C11965500BT）
胎牛血清（GIBCO 10099-141），必須與我們保持一致，如堅(jiān)持使用不同貨號(hào)培養(yǎng)基或者血清培養(yǎng)，產(chǎn)生售后問(wèn)題，不予支持補(bǔ)發(fā)。培養(yǎng)基正常 pH 值為 7.2-7.4，顏色呈現(xiàn)微紅偏黃，若顏色發(fā)生偏差變化，需要盡快更換完全培養(yǎng)基。
七、凍存細(xì)胞收貨注意事項(xiàng)
收到細(xì)胞后，當(dāng)天存入-80℃冰箱或者-196℃的液氮罐中保存！該細(xì)胞訂單用戶(hù)訂購(gòu)前，需核實(shí)確認(rèn)（凍存細(xì)胞以收到細(xì)胞后起 14 天之內(nèi)為售后保障期 ，不是保存多日開(kāi)始復(fù)蘇后的 14 天之內(nèi) ）
培養(yǎng)基貨號(hào) DMEM(HYCLONE SH30022.01 或 GIBCO C11965500BT）
胎牛血清（GIBCO 10099-141），必須與我們保持一致，如堅(jiān)持使用不同貨號(hào)培養(yǎng)基或者血清培養(yǎng)，產(chǎn)生售后問(wèn)題，不予支持補(bǔ)發(fā)。培養(yǎng)基正常 pH 值為 7.2-7.4，顏色呈現(xiàn)微紅偏黃，若顏色發(fā)生偏差變化，需要盡快更換完全培養(yǎng)基。
八、常見(jiàn)問(wèn)題
1、運(yùn)輸途中，細(xì)胞會(huì)因?yàn)榛蝿?dòng)造成細(xì)胞脫落，此現(xiàn)象為正?，F(xiàn)象，觀(guān)察后，靜置 3 小時(shí)。
2、傳代后細(xì)胞漂浮原因：傳代前密度過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞擠出凋亡；消化過(guò)度；移液槍吹打力道過(guò)大。
3、細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁性不好，嘗試換液并血清提至 15%，待觀(guān)察，若效果還不佳，需要聯(lián)系銷(xiāo)售及技術(shù)老師。
4、本產(chǎn)品有添加支原體抗污染劑及三抗（青霉素，鏈霉素，兩性霉素 B），若收到細(xì)胞后 2 天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染，請(qǐng)立即聯(lián)系對(duì)應(yīng)銷(xiāo)售進(jìn)行補(bǔ)發(fā)；3-14 天之內(nèi)的污染，需要聯(lián)系對(duì)應(yīng)銷(xiāo)售溝通并且核實(shí)詳情后，進(jìn)行下一步售后處理。
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