UMR-106大鼠骨肉瘤細胞的培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-01-22 09:14:53
一、背景
UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)也被稱為大鼠骨肉瘤細胞，是一種通過注射放射性同位素磷(32P)誘導(dǎo)產(chǎn)生的可移植性大鼠骨肉瘤克隆而建立的細胞株。這種細胞對甲狀旁腺激素（PTH）、前列腺素以及破骨甾體有響應(yīng)。值得注意的是，與相關(guān)的細胞株UMR-108相比，UMR-106對PTH的響應(yīng)度更高。蛋白激酶C的活化能夠抑制ATP誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣水平的升高。
這種細胞通常在特定的培養(yǎng)基中生長，如DMEM培養(yǎng)基，并需要添加胎牛血清以提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)條件包括適宜的溫度（通常是37攝氏度）和特定的氣體環(huán)境（如空氣和二氧化碳的混合氣體）。
UMR-106細胞株的建立和研究為骨肉瘤和其他相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究提供了有價值的實驗?zāi)Ｐ?。通過對這種細胞的研究，科學(xué)家們可以深入了解骨肉瘤的發(fā)生機制、發(fā)展過程以及潛在的治療方法。此外，這種細胞也常用于藥物篩選和毒性測試等實驗研究中。
1)復(fù)蘇UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
目的：
1、構(gòu)建大鼠骨肉瘤“原位移植-肺轉(zhuǎn)移”模型，為研究KISS1/GPR54系統(tǒng)對大鼠骨肉瘤的影響構(gòu)建實驗平臺。
2、檢測KISS1/GPR54系統(tǒng)在大鼠骨組織和骨肉瘤模型中的表達。
3、研究KISS1的多肽片段對骨肉瘤UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)細胞遷移、侵襲能力的影響。
4、構(gòu)建大鼠KISS1基因重組慢病毒并感染UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)，獲得穩(wěn)定表達外源性KISS1基因的UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)106細胞。5.探討大鼠KISS1基因修飾對于大鼠骨肉瘤的影響及可能機制。
方法：
1、使用鋇劑測定大鼠脛骨骨髓腔容積，向骨髓腔內(nèi)注射適量的大鼠骨肉瘤UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)細胞懸液，觀察脛骨原位腫瘤生長和肺部轉(zhuǎn)移情況，應(yīng)用RT-PCR檢測堿性磷酸酶（ALP）、骨橋蛋白（OPN）在細胞、原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中的表達
2、采用RT-PCR法和Western Blot法，從mRNA水平和蛋白水平檢測KISS1和GPR54在大鼠骨組織、UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)、裸鼠模型的原位腫瘤組織中的表達情況。
3、采用50nM、100nM、200nM三個劑量的Kp-10（Kisspeptin10肽片段）作用于UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)單細胞層，劃痕實驗和Transwell實驗分別觀察細胞遷移和侵襲能力的變化。
4、構(gòu)建攜帶大鼠KISS1基因的重組慢病毒并感染UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)，通過熒光表達法判定感染復(fù)數(shù)（Multiplicities of Infection,MOI），Western Blot檢測感染前后的細胞中KISS1蛋白的表達情況。
5、體外實驗：劃痕實驗和Transwell實驗測定轉(zhuǎn)染前后各組細胞的遷移、侵襲能力的變化。Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后各組細胞MMPs，TIMPs的表達變化。體內(nèi)實驗：觀察轉(zhuǎn)染前后各組細胞原位模型的腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。
結(jié)果：
1、建立了骨肉瘤“原位移植-肺轉(zhuǎn)移”模型。UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)、原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中均表達骨肉瘤標記物ALP、OPN。
2、KISS1mRNA和蛋白在UMR-106細胞中表達很低，在荷瘤鼠的原位腫瘤中表達極低，在骨組織中的表達量低于肝組織。GPR54在上述組織中均有表達。
3、Kp-10作用后的UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)的遷移距離縮短，穿膜細胞數(shù)量減少（P<0.05）。
4、構(gòu)建了大鼠KISS1基因重組慢病毒載體，感染UMR-106(大鼠骨肉瘤細胞)最佳MOI值為20。轉(zhuǎn)染后的UMR-106細胞KISS1蛋白的表達量明顯增加，并能持續(xù)表達40天以上。
5、體外實驗：轉(zhuǎn)染KISS1基因的UMR-KISS1細胞的遷移距離縮短和穿膜細胞數(shù)量減少，MMP-2、MMP-9的表達量降低，TIMP-1、TIMP-2的表達量升高。體內(nèi)實驗：UMR-KISS1組裸鼠模型的原位腫瘤體積縮小，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量減少。
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