184A1人乳腺上皮細(xì)胞系的應(yīng)用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-02-15 10:25:42
一、背景
184A1人乳腺上皮細(xì)胞系是一種常用的細(xì)胞系，被廣泛應(yīng)用于乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。以下是關(guān)于該細(xì)胞系的一些基本信息：
背景：184A1細(xì)胞系來源于一名女性乳腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本，并通過一系列的傳代培養(yǎng)而建立。這些細(xì)胞形態(tài)上類似于正常的乳腺上皮細(xì)胞，但具有無限增殖的能力。
形態(tài)特征：上皮細(xì)胞樣。
培養(yǎng)條件：通常需要在37°C、5%CO2和95%濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并使用特定的培養(yǎng)基進(jìn)行營養(yǎng)支持。
用途：廣泛用于研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)防等方面，以及測試新的藥物和治療方法的效果。
1)復(fù)蘇184A1人乳腺上皮細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)184A1人乳腺上皮細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)184A1人乳腺上皮細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
利用RNA干擾技術(shù),以乳腺癌細(xì)胞為研究對象,下調(diào)乳腺癌細(xì)胞系中的基因CCR7的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響,并行蛋白質(zhì)譜檢測,研究沉默CCR7后哪些蛋白和信號分子參與CCR7的調(diào)控作用,對探討CCR7與乳腺癌轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)具有積極的意義。
方法：
1、常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮細(xì)胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A,用q-PCR和Westen blot實(shí)驗(yàn)篩選出高表達(dá)CCR7的乳腺癌細(xì)胞系。
2、對篩選出來的乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染,提取實(shí)驗(yàn)組(CCR7-siRNA)和對照組的總RNA和總蛋白,用q-PCR和Western blot檢測干擾效果。
3、利用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測了siCCR7轉(zhuǎn)染對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響。
4、通過蛋白質(zhì)譜結(jié)果篩選出差異表達(dá)蛋白,并用q-PCR驗(yàn)證參與CCR7的調(diào)控作用關(guān)鍵蛋白。
結(jié)果：
1、高表達(dá)CCR7的乳腺癌細(xì)胞系的篩選q-PCR結(jié)果顯示:人乳腺癌細(xì)胞株T47D、HCC1500、SK-RB-3、BT474、MCF7的CCR7的mRNA表達(dá)水平較其他乳腺癌細(xì)胞株高。高表達(dá)CCR7的乳腺癌細(xì)胞系的篩選Western blot結(jié)果顯示:CCR7在小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1-Luc、人乳腺癌細(xì)胞株T74D、MCF7中高表達(dá),在部分乳腺癌細(xì)胞株中如MB231、MB468、HCC1937中有較高水平的表達(dá)。但是在正常乳腺細(xì)胞株如184B5、184A1人乳腺上皮細(xì)胞系和MCF10A中幾乎無CCR7表達(dá)。最后我們選取MCF7及T47D乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
2、T47D、MCF7細(xì)胞在經(jīng)過siRNA處理后,通過q-PCR檢測對T47D、MCF7乳腺癌細(xì)胞的沉默效應(yīng),結(jié)果顯示CCR7-siRNA和CCR7-siRNA能非常有效地抑制T47D、MCF7細(xì)胞中內(nèi)源性CCR7的mRNA水平的表達(dá)。Western blot得到相似的結(jié)果。
3、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮細(xì)胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,與shLacZ組比,shCCR7C組和shCCR7D組乳腺癌細(xì)胞遷移能力變?nèi)酢?/div>
4、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮細(xì)胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A通過蛋白質(zhì)譜結(jié)果篩選出差異表達(dá)蛋白如下:EPHA2、PVR、SQSTM1、ANXA6、PTRF、ALDH3A2、EPCAM。并用q-PCR方法及Western blot方法驗(yàn)證沉默CCR7后ALDH3A2和PTRF可能參與CCR7的調(diào)控作用。
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