小鼠膀胱癌細胞的特點與應用及培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-03-13 09:22:28
一、背景
小鼠膀胱癌細胞是指在小鼠體內培育出的膀胱癌細胞系。這些細胞系通常來自于小鼠的膀胱組織，經過一系列的實驗室操作，如分離、培養(yǎng)和傳代，最終形成穩(wěn)定的細胞系。
形態(tài)特征：小鼠膀胱癌細胞通常呈多角形或長條形，大小不一，有明顯的核仁和胞質。
生長特性：小鼠膀胱癌細胞具有較強的增殖能力，可以在體外持續(xù)傳代，并且可以在體內形成腫瘤。
基因表達：小鼠膀胱癌細胞系通常表達多種與膀胱癌相關的基因，如VEGF、EGFR等。
小鼠膀胱癌細胞系在生物學研究中具有廣泛的應用價值，例如用于研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制、篩選抗腫瘤藥物、評估治療效果等。同時，由于小鼠與人類在生理和病理方面存在一定的相似性，因此小鼠膀胱癌細胞系也被廣泛應用于人類腫瘤的研究中。
1)復蘇小鼠膀胱癌細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)小鼠膀胱癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠膀胱癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。
b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應用
研究均一豬苓多糖(homogeneous polyporus polysaccharide,HPP)對膀胱癌細胞自噬的影響,探討HPP通過調節(jié)自噬抗膀胱癌的作用機制,為膀胱癌治療提供實驗數據。
方法：建立BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,成瘤后將小鼠隨機分為陰性對照組、陽性對照吉西他濱(Gemcitabine,Gem)組、HPP低/中/高劑量組,分別給予對應藥物腹腔注射。給藥期間,每天觀察小鼠生命體征等情況,每隔一天稱體重,并用游標卡尺測量腫瘤最大徑(a)及最小徑(b),計算腫瘤體積。給藥結束后,取小鼠腫瘤拍照、稱重。并采用Western blot檢測腫瘤組織中自噬及其相關蛋白Beclin1及p62的表達。
建立模擬體外腫瘤微環(huán)境的RAW264.7與小鼠膀胱癌細胞(小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞))共培養(yǎng)模型,將其分為對照組及HPP低、中、高劑量組。共培養(yǎng)24h后,采用細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)實驗及5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)實驗檢測HPP對小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)增殖能力的影響。
采用單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)熒光染色實驗檢測細胞質中自噬體的形成,并采用Western blot檢測自噬相關蛋白SirT1、Beclin1、p62、LC3BⅡ的表達。再采用Western blot檢測自噬上游信號通路PI3K/Akt/mTOR蛋白的表達。然后,加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA),檢測細胞質中自噬體形成的變化、自噬標志蛋白LC3BⅡ表達的變化,及小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)增殖能力的變化。
采用Western blot檢測小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)在單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)細胞模型中自噬相關蛋白SirT1、Beclin1、p62的表達情況,并檢測HPP單獨作用對小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)自噬相關蛋白SirT1、Beclin1、p62表達的影響。
結果：體內實驗結果：
1、與陰性對照組相比,Gem組小鼠體重明顯下降(P<0.05),小鼠腫瘤體積和重量無明顯變化(P>0.05)。
2、與陰性對照組相比,HPP各濃度組小鼠體重均呈增加的趨勢,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Gem組相比,HPP各濃度組小鼠體重顯著增加(P<0.05)。
3、與陰性對照組相比,HPP各濃度組小鼠腫瘤體積無明顯變化(P>0.05),腫瘤重量呈下降趨勢,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
4、與陰性對照組相比,HPP各濃度組小鼠腫瘤組織中Beclin1蛋白表達升高(P<0.05),p62蛋白表達降低(P<0.05)。
體外實驗結果：
1、在共培養(yǎng)細胞模型中,與對照組相比,HPP能抑制小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)的增殖能力(P<0.05),誘導小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)發(fā)生自噬,表現為細胞質中自噬體形成增多,且細胞中p62蛋白表達減少(P<0.05),SirT1、Beclin1、LC3BⅡ蛋白表達升高(P<0.05)。同時,經HPP處理后,與對照組相比,小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)中PI3K/Akt/mTOR信號通路總蛋白及磷酸化蛋白的表達均降低(P<0.05)。加入3-MA后,與HPP組相比,細胞質中自噬體形成減少,LC3BⅡ蛋白表達降低(P<0.05),HPP誘導的自噬被抑制,且HPP對小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)增殖抑制的效應減弱(P<0.05)。
2、與單獨培養(yǎng)相比,小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)在共培養(yǎng)細胞模型中自噬相關蛋白SirT1、Beclin1、p62的表達無明顯變化(P>0.05)。
3、與空白組相比,HPP單獨處理后,小鼠膀胱癌細胞(MB49細胞)中SirT1、p62蛋白的表達無明顯變化(P>0.05),Beclin1蛋白的表達呈上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
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