如何選擇最優(yōu)的菌種保藏方法？是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作！
小楊 / 2024-11-09 10:44:04
百歐博偉生物：菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種。而微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。
而微生物在保存過程中的存活率和壽命取決于哪些關(guān)鍵因素？
（1）懸浮液和復(fù)水液的成分，
（2）所用低溫保護(hù)劑的類型，
（3）冷卻和解凍的速率，
（4）培養(yǎng)物的生長階段，
（5）細(xì)胞的大小和類型、脂質(zhì)含量、水分含量以及初始細(xì)胞密度。
一、菌種保藏的方法
1、定期移植法
此方法有時也稱為傳代培養(yǎng)法，該方法是一般微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的保藏方法之一。根據(jù)不同微生物生長繁殖所需條件的不同，將需要保藏的菌種接種至適宜的斜面或者液體培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于 4℃～ 6℃條件下保存，保藏時間一般為 4 個月～ 6 個月，隔一段時間進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。應(yīng)注意對于副溶血性弧菌等弧菌不可采用冷藏方法進(jìn)行保藏。
優(yōu)點(diǎn)是操作不復(fù)雜，觀察方便，且對人員要求不高，一般微生物從業(yè)人員均可順利完成，是微生物檢測的基礎(chǔ)操作?；静恍枰厥鈨x器設(shè)備，成本較低，應(yīng)用范圍廣。
缺點(diǎn)是工作強(qiáng)度大，無法保存較長時間，需要頻繁進(jìn)行傳代移植，而且在移植過程中極易造成污染和菌種的退化。
2、傳代培養(yǎng)法
菌種斜面的保存
傳代用菌種采用斜面冷藏保存。
將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，生長充分后，轉(zhuǎn)移至冰箱冷藏保存，以備實(shí)驗(yàn)傳代用。此法用于實(shí)驗(yàn)用菌種的短期保存，隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常，滅菌處理后銷毀。
保存時間與菌種類型有關(guān)，一般存儲時間不超過 9 周，
銅綠假單胞菌和
分枝桿菌不超過 6 周，如保存期內(nèi)，斜面出現(xiàn)缺水、干裂等情況，滅菌處理后銷毀。菌種凍存管的保存
菌種可采用甘油、液體石蠟、瓷珠等方式凍存，根據(jù)其特性選擇適宜凍存方法，常用方法見下方。凍存管注明菌種名稱、菌種號、凍存日期等基本信息。菌種凍存管在-80℃保存不宜超過18個月。可間隔一段時間，將菌種凍存管復(fù)蘇后，重新凍存。
3、真空冷凍干燥法
準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥 菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，可用長頸球形底安瓿管或管狀安瓿管，將安瓿管清洗干凈，烘干，管口塞好脫脂棉塞，121℃ 滅菌30 min，備用。
菌懸液的制備及分裝在無菌條件下，用2 mL～3 mL脫脂牛乳將生長良好的純菌培養(yǎng)物從斜面上洗脫下來，制成菌懸液，分裝入安瓿管，每支安瓿管分裝0.1 mL～0.2 mL。B.3.3 預(yù)凍 -80℃預(yù)凍1 h～2 h。
冷凍干燥 將冷凍后的安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8 h～20 h。終止干燥時間根據(jù)下列情況判斷：a)安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；b)真空度接近空載時的最高值；c) 選用1～2支對照管，其中加水與菌懸液同量，若對照管中水份已干燥，視為干燥完結(jié)。
保存許多細(xì)菌、酵母和產(chǎn)孢真菌時，凍干效果較好，但對于非產(chǎn)孢真菌（營養(yǎng)菌絲）、某些種類的酵母（如Lipomyces、Leucosporidium、Brettanomyces、Dekkera、Bulleera、Sporobolomyces）和某些細(xì)菌[如Aquaspirillum serpens、Clostridium botulinum、Helicobacter pylori]的保存效果并不理想。在真空干燥過程中，凍干會對細(xì)胞產(chǎn)生壓力，而在壓力下培養(yǎng)的細(xì)胞可能對凍干有更好的適應(yīng)性。采用真空冷凍技術(shù)，將菌種冷凍干燥成菌粉后長期保存。菌種管注明菌種名稱、菌種號、日期等基本信息，-20℃±2℃冷凍保藏。
優(yōu)點(diǎn)是保存期限長，可達(dá)到 10 年以上，且攜帶、運(yùn)輸方便，菌種的存活率和穩(wěn)定性均較高。
缺點(diǎn)是對設(shè)備要求高，需要專業(yè)的冷凍真空干燥設(shè)備，投入相對較高；對人員操作水平要求高，操作方法相對繁瑣，通常專業(yè)化的菌種保藏機(jī)構(gòu)選用此種方法；冷凍干燥過程對菌體有一定損傷，需進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
4、甘油冷凍管保存法
用無菌接種環(huán)刮取平板或瓊脂斜面的培養(yǎng)物，放入裝有無菌純化水的試管中，通過接種環(huán)與試管壁間的摩擦，使細(xì)菌充分?jǐn)U散到純化水中，制備成菌懸液。向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，充分混合后，分裝于無菌小試管或凍存管，冷凍保存。
小提示：
一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍快化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，直接放入37℃快速融化后使用。
另一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍慢化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，逐級融化后使用。
實(shí)際使用時，甘油管直接-80℃冷凍保藏，使用時取出來直接用手捂熱使用，也是符合第一種說法的。
效果到底哪種方式好，還需要繼續(xù)研究，等待進(jìn)一步數(shù)據(jù)。
每半年進(jìn)行一次菌種確認(rèn)試驗(yàn)，通過平板劃線分離、觀察菌落形態(tài)、染色鏡檢等常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)菌的存活情況。
5、液體石蠟保存法
無菌液體石蠟的制備選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，121℃ 30 min壓力蒸汽滅菌后，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，備用。
液體石蠟管的制備 將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1 cm，使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃ 冷凍或冷藏保存。
優(yōu)點(diǎn)是保存時間相對較長，可達(dá)到 2 年～ 10 年，并且操作簡單，使用方便，對于很多真菌的保藏也適用，可用于保存霉菌、酵母菌、放線菌及需氧菌，方法簡便，可防止斜面干燥和氧氣進(jìn)入，但一些固氮菌、分枝桿菌、毛霉、厭氧菌等不適宜用此法。
缺點(diǎn)是對人員操作水平有一定要求，且操作強(qiáng)度大，成本高。在使用礦物油時要注意防止污染和防范火災(zāi)，且直立的試管需要對存放空間有較高要求，攜帶十分不便。
6、載體保藏法
此方法又稱為干燥保藏法。一般會依據(jù)選擇載體的不同，最常采用沙土管、明膠片、濾紙保藏法。對于產(chǎn)孢子或有芽孢的霉菌和放線菌都可以用這種方法進(jìn)行保藏。
優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，所需儀器設(shè)備簡單，而且便于攜帶。
缺點(diǎn)是對營養(yǎng)細(xì)胞不適用，使用范圍相對較窄。
7、液氮冷凍保藏法
此方法有時也稱為液氮超低溫凍結(jié)保藏法。將懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移至 -196℃的液氮或 -150℃的液氮?dú)庀嘀斜４娴姆椒ā７椒ㄒ笈鋫湟恍Ｓ迷O(shè)備，如液氮冰箱、液氮儲藏器等，需要使用甘油、吐溫 80 等保護(hù)劑。此方法適用于支原體、衣原體等采用冷凍干燥法難以保藏的菌種，是很多菌種保藏機(jī)構(gòu)選擇較多的方法。
優(yōu)點(diǎn)是菌種保藏時間較長，菌種存活率高，且不易發(fā)生變異及退化。
缺點(diǎn)是操作相對復(fù)雜，對人員操作水平要求高；設(shè)備昂貴，需要定期補(bǔ)充液氮，保藏成本高。同時需注意防爆危險的發(fā)生。
8、-80℃冰箱凍結(jié)法
此方法是將菌種懸浮于保護(hù)劑中置于 -80℃冰箱凍結(jié)保存的一種長期保藏菌種的方法，一般可保藏 2 年～ 5 年。
優(yōu)點(diǎn)是使用較方便且保存時間較長。
缺點(diǎn)是不利于運(yùn)輸和攜帶，對設(shè)備要求較高，需要配備 -80℃的低溫冰箱。
二、復(fù)蘇與傳代
以無菌操作方式開啟凍干菌種管，加入適量培養(yǎng)液（按菌種選擇培養(yǎng)液，如細(xì)菌選擇營養(yǎng)肉湯、白色念珠菌選擇沙堡液體培養(yǎng)基(SDA)、分枝桿菌選擇蘇通綜合液體培養(yǎng)基(Sauton Broth Medium Base)、黑曲霉菌選擇麥芽浸膏肉湯培養(yǎng)基（MEB 培養(yǎng)基），吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5.0 mL～10.0 mL 相應(yīng)培養(yǎng)液的試管，滴入少許菌種懸液，在適宜溫度下培養(yǎng)（一般為 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18 h～24 h、黑曲霉菌為 30℃± 1℃ 培養(yǎng) 42 h～48 h），此為第 1 代培養(yǎng)物。
用接種環(huán)取第 1 代培養(yǎng)物，或從菌種凍存管中取適量菌液/瓷珠，劃線接種于相應(yīng)培養(yǎng)基平板（按菌種選擇培養(yǎng)基，如細(xì)菌選擇營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、白色念珠菌選擇沙堡瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、分枝桿菌選擇改良羅氏培養(yǎng)基（martin broth modified）或其他商品化分枝桿菌專用復(fù)合瓊脂培養(yǎng)基、黑曲霉菌選擇麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基（MEA），在適宜溫度下培養(yǎng)（一般為 36℃±1℃培養(yǎng) 18 h～24 h、分枝桿菌 36℃± 1℃培養(yǎng) 72 h、黑曲霉菌 30℃±1℃ 培養(yǎng) 42 h～48 h），此為第 2 代培養(yǎng)物。
挑取第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于相應(yīng)培養(yǎng)基斜面或平板（按菌種選擇培養(yǎng)基斜面，如細(xì)菌選擇營養(yǎng)瓊脂斜面、白色念珠菌選擇沙堡瓊脂(SDA)斜面、分枝桿菌選擇改良羅氏培養(yǎng)基（martin broth modified）或其他商品化分枝桿菌專用復(fù)合瓊脂斜面、黑曲霉菌選擇麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基（MEA）平板），在適宜溫度下培養(yǎng)（一 般為 36℃±1℃培養(yǎng) 18 h～24 h、分枝桿菌 36℃±1℃培養(yǎng) 72 h、黑曲霉菌 30℃±1℃培養(yǎng) 42 h～ 48 h），此為第 3 代培養(yǎng)物。
取第 3 代培養(yǎng)物，接種于相應(yīng)培養(yǎng)基斜面，在適宜溫度下培養(yǎng)，此為第 4 代培養(yǎng)物。
按上述方法培養(yǎng)至所需代數(shù)，傳代時在試管上注明菌種名稱、菌種號、代數(shù)及傳代日期等基本信息。
三、相關(guān)法規(guī)
在《2020中國藥典》的9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則中就有說明，標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株保存時，可將培養(yǎng)物等份懸浮于抗冷凍的培養(yǎng)基中，并分裝于小瓶中，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于一30℃）等方法保存。低于-70℃或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時間。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周1次轉(zhuǎn)種的工作菌株。冷凍菌種一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后，不得重新冷凍和再次使用。
《中國藥典》2020年版三部 生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制中菌毒種的保存
1、菌毒種經(jīng)檢定后，應(yīng)根據(jù)其特性，選用凍干、液氮、≤－60℃凍存或其他適當(dāng)方法及時保存。
2、不能凍干、液氮、≤－60℃凍存的菌毒種，應(yīng)根據(jù)其特性，置適宜環(huán)境至少保存2份或保存于兩種培養(yǎng)基。
3、保存的菌毒種傳代、凍干、液氮、≤－60℃凍存均應(yīng)填寫專用記錄。
4、保存的菌毒種應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽，標(biāo)明菌毒種編號、名稱、代次、批號和制備日期等內(nèi)容。
5、非生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)與生產(chǎn)用菌毒種嚴(yán)格分開存放。工作種子批與主種子批應(yīng)分別存放。每批種子批應(yīng)有備份，并應(yīng)在不同地方保存。
<USP 1117>從國家菌種庫或合格的二級供應(yīng)商處獲取的原始菌種將在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中復(fù)蘇并生長。該庫存菌種（首次傳代或轉(zhuǎn)接）的部分樣本懸浮于冷凍保護(hù)劑中，分裝至小瓶中，并在-30℃或以下溫度冷凍保存，直至使用。如果保存在-70℃或以下溫度或以凍干形式保存，菌株可無限期保存。這些冷凍庫存可用于接種每月或每周的工作培養(yǎng)物。一旦打開，在工作懸浮液培養(yǎng)后，未使用的細(xì)胞懸浮液不應(yīng)再次冷凍。應(yīng)丟棄未使用的部分，以最大程度地降低庫存失去活性和被污染的風(fēng)險。
微生物菌種保藏的目標(biāo)不僅是實(shí)現(xiàn)長期存活，還要保持其保存菌種的基因型和表型穩(wěn)定性，因?yàn)榛蛐秃捅硇偷耐暾詫τ隍?yàn)證以往的研究發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。
在保存前后，必須在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)和分子水平上對菌種進(jìn)行全面表征。通常，對活性菌種進(jìn)行亞培養(yǎng)會誘導(dǎo)更多突變。使用凍干和低溫保存方法保存的菌種表現(xiàn)出更高的基因型和表型穩(wěn)定性，但仍需優(yōu)化以獲得更好的結(jié)果。
有研究對木霉屬（Trichoderma spp.）菌種保存后的基因組完整性進(jìn)行了評估，結(jié)果表明，像低溫保存這樣穩(wěn)健的方法有時也會誘發(fā)遺傳改變。同樣，有研究評估了細(xì)菌生物降解潛力的穩(wěn)定性，并得出結(jié)論：“使用正確的保存方法和低溫保護(hù)劑對于避免遺傳改變至關(guān)重要。”
微數(shù)生物擁有特定微生物的快檢技術(shù)平臺開發(fā)，可基于定量PCR、數(shù)字PCR和等溫PCR、 CRISPR 等技術(shù)開發(fā)微生物核酸快檢解決方案。在DNA二代高通量測序、全基因序列測定、鑒定以及遺傳穩(wěn)定性檢測領(lǐng)域的能力，已全面獲得中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）的權(quán)威認(rèn)可。
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