尋找每個(gè)細(xì)胞間的微小差異，單細(xì)胞技術(shù)為什么行？
小楊 / 2024-12-14 09:36:36
百歐博偉生物：世上沒(méi)有兩片完全相同的樹葉，也沒(méi)有兩個(gè)完全相同的細(xì)胞。
細(xì)胞是人體功能的最基本單位。人類從一顆受精卵開(kāi)始，逐漸演變成一個(gè)約120萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞的成人，這些細(xì)胞共享著同一套遺傳信息，卻在表達(dá)過(guò)程中產(chǎn)生了個(gè)體差異。正是這些或多或少的差異，影響著生物體的功能乃至健康。
科學(xué)家由此產(chǎn)生了一個(gè)瘋狂的想法：想真正了解人體，也許可以從了解每一個(gè)細(xì)胞的差異開(kāi)始。于是，以基因測(cè)序?yàn)榍腥朦c(diǎn)，人類拉開(kāi)了單細(xì)胞研究的大幕。
目前，單細(xì)胞研究主要是為RNA測(cè)序 ，由于RNA（轉(zhuǎn)錄組）能決定基因表達(dá)情況而最終導(dǎo)致細(xì)胞差異，因此有著更為廣闊的應(yīng)用場(chǎng)景，包括研究腫瘤異質(zhì)性，免疫細(xì)胞多樣性，疾病發(fā)生機(jī)理，以及尋找新藥物靶點(diǎn)等。
這項(xiàng)技術(shù)目前還主要服務(wù)于科研而非臨床，但2015年后，相關(guān)論文集中在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊發(fā)表；10x Genomics 和BD Rhapsody等國(guó)際知名企業(yè)陸續(xù)成立。這一切事實(shí)都宣告單細(xì)胞測(cè)序已經(jīng)初步克服了單細(xì)胞捕獲通量受限這一核心瓶頸，完成了商業(yè)化落地。
未來(lái)，單細(xì)胞研究將朝臨床方向邁進(jìn)。多組學(xué)和空間位置信息等多層次信息證據(jù)整合的趨勢(shì)已經(jīng)成為共識(shí)。
雖然從國(guó)內(nèi)情況來(lái)看，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)起步較晚，大部分公司還處于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和早期市場(chǎng)驗(yàn)證階段。但可以肯定的是，對(duì)于這項(xiàng)2009年才誕生的年輕技術(shù)，無(wú)論學(xué)界、企業(yè)界還是資本方都保持著充足的耐心與期待。
從更高分辨率解碼生命
貝瑞基因單細(xì)胞業(yè)務(wù)科技服務(wù)部技術(shù)支持總監(jiān)李哲對(duì)單細(xì)胞測(cè)序有著一個(gè)形象比喻：“組織測(cè)序像是一口吃掉一串葡萄，當(dāng)中有酸有甜，但我們無(wú)從分辨，只能品嘗到一個(gè)整體的、綜合的口味，而單細(xì)胞則是一顆一顆品嘗。”
在生物體上，如此聚焦在單細(xì)胞的基因測(cè)序可以幫我們找到每一顆“酸葡萄”，相當(dāng)于從更高的分辨率解碼生命。而這一想法最早被學(xué)界廣泛關(guān)注是在2013年。
在整個(gè)基因測(cè)序領(lǐng)域，2013年都是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。這一年，科學(xué)家們對(duì)早在十年前就宣布完成的人類基因組計(jì)劃進(jìn)行了打補(bǔ)丁和總結(jié)，發(fā)布了參考基因組序列GRCh38，被認(rèn)為是當(dāng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)人類參考基因組。
科學(xué)家總是“貪婪的”，拿到基因圖譜后，便順理成章地開(kāi)始了對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析，去界定已經(jīng)解析的基因在人的所有細(xì)胞中將如何表達(dá)和變化。于是這一年，單細(xì)胞測(cè)序榮膺《自然-方法》的年度技術(shù)。
單細(xì)胞測(cè)序是相對(duì)于組織測(cè)序產(chǎn)生的概念。簡(jiǎn)單而言，就是通過(guò)NGS 技術(shù)檢查來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的序列信息來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞差異，并更好地了解單細(xì)胞的功能。
這一暢想在2003年宣布人類基因組草圖初步繪制完成時(shí)還是天方夜譚，因?yàn)閱渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)2009年才橫空出世，邁出這一步的是北京大學(xué)教授湯富酬。他在英國(guó)劍橋大學(xué)Gurdon研究所做博士后研究期間，發(fā)表了全球首個(gè)單細(xì)胞mRNA 建庫(kù)測(cè)序方案，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的全基因表達(dá)測(cè)序。
這一研究成果在單細(xì)胞領(lǐng)域內(nèi)樹起了第一座里程碑，但缺點(diǎn)是細(xì)胞分離、捕獲的成本十分高昂，由此帶來(lái)的問(wèn)題是只能檢測(cè)少量細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)、通量很低。因此該方案只能用于神經(jīng)細(xì)胞、生殖細(xì)胞等稀有細(xì)胞的研究。
在流程方面，單細(xì)胞測(cè)序需要先將組織或體液中的細(xì)胞群分離成單個(gè)細(xì)胞，再對(duì)提取基因進(jìn)行一定倍數(shù)擴(kuò)增，使之達(dá)到現(xiàn)有測(cè)序深度的可及水平再展開(kāi)測(cè)序，最終獲取細(xì)胞異質(zhì)性等關(guān)鍵信息。
事實(shí)上，比起測(cè)序本身，測(cè)序前處理才是單細(xì)胞測(cè)序的核心壁壘。人體細(xì)胞的平均直徑只有10-20微米，如何從組織中解離和捕獲這么小的細(xì)胞并形成規(guī)模效應(yīng)，是從組織測(cè)序通往單細(xì)胞測(cè)序路上最大的攔路虎。
李哲解釋：“早期我們需要用口吸管，在顯微鏡下把它吸出來(lái)，或者是激光顯微切割技術(shù)，把細(xì)胞一個(gè)個(gè)地從組織上切下來(lái)，然后放到一個(gè)獨(dú)立體系中做擴(kuò)增、建庫(kù)、測(cè)序。” 顯然，李哲口中的這些方式需要極大的人力和金錢成本，而這一糟糕的情況在2015年才有了轉(zhuǎn)機(jī)。
打破“低通量”桎梏
高通量的大門終于要被叩開(kāi)了。
2015年，Steven A. McCarroll 等研究者在《細(xì)胞》上發(fā)表了基于微滴包裹單細(xì)胞和捕獲磁珠技術(shù)的Drop-Seq方案，之后不久，Stephen P. A. Fodor等研究者也在《科學(xué)》上發(fā)表了基于微孔板分散、分隔單細(xì)胞及捕獲磁珠技術(shù)的 Cyto-Seq 方案，同年問(wèn)世的兩種方案成為了開(kāi)啟高通量大門的鑰匙。
“兩把鑰匙”對(duì)單細(xì)胞的 mRNA 建庫(kù)進(jìn)行了大幅成本優(yōu)化，引發(fā)了行業(yè)極大反響，以至于兩種方案公布后分別被迅速商業(yè)化，形成了當(dāng)下全球范圍內(nèi)最頭部的兩家單細(xì)胞測(cè)序企業(yè)10x Genomics和BD Rhapsody。
李哲介紹，在2015年之前，傳統(tǒng)單細(xì)胞測(cè)序的通量只有幾十到上百個(gè)細(xì)胞。而如今的10x Genomics和BD Rhapsody等高通量單細(xì)胞平臺(tái)能一次性實(shí)現(xiàn)成千上萬(wàn)的單細(xì)胞通量，一些情況下甚至能達(dá)到一次性捕獲60到70萬(wàn)細(xì)胞的高通量水平。
Drop-Seq方案（微流控）和Cyto-Seq方案（微孔板）本質(zhì)上核心邏輯一致：給每個(gè)細(xì)胞加上特有的標(biāo)簽序列，進(jìn)行測(cè)序時(shí)把攜帶相同標(biāo)簽的序列視為來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞，這樣一次建庫(kù)就可以測(cè)獲單細(xì)胞的信息。
“簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，微流控可以簡(jiǎn)單理解為通過(guò)水管一滴一滴地滴水，將單細(xì)胞捕獲到液滴中；而微孔板則類似把一群細(xì)胞從半空中拋下，它們會(huì)根據(jù)物理規(guī)律（泊松分布），分布到一些微孔當(dāng)中。”諾禾致源單細(xì)胞業(yè)務(wù)負(fù)責(zé)人齊煒在采訪中告訴億歐大健康，兩種方案間沒(méi)有明顯的優(yōu)劣勢(shì)，只是到達(dá)同一目的地的兩種不同工具。
其實(shí)，無(wú)論微流控還是微孔板，希望達(dá)到的目的都是讓單細(xì)胞成規(guī)模的形成獨(dú)立反應(yīng)體系，只不過(guò)前者利用液滴，后者利用了微孔。兩種方案共同把單細(xì)胞測(cè)序送入了高通量時(shí)代。
高通量時(shí)代不僅是形容單細(xì)胞的捕獲效率，也暗示著單細(xì)胞測(cè)序自身的高速發(fā)展。
2016、2017兩年，10x Genomics和BD Rhapsody先后推出了自己的單細(xì)胞分析系，用于測(cè)序后端的數(shù)據(jù)分析。 在2017 年 10 月，國(guó)際合作項(xiàng)目“人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃（Human Cell Atlas，HCA）”正式公布，全世界的研究者們希望同人類基因組計(jì)劃一樣能繪制一張細(xì)胞圖譜，囊括人類所有細(xì)胞類型的基因表達(dá)特征。
這一國(guó)際重磅計(jì)劃徹底點(diǎn)燃行業(yè)的熱情。2018年，單細(xì)胞被《科學(xué)》期刊評(píng)為十大科學(xué)突破技術(shù)；僅一年后，單細(xì)胞又一次入選《自然》的生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)。在齊煒的印象中，2018年“能明顯感到（單細(xì)胞測(cè)序）起勢(shì)”，到2019年，則已然“在圈子里成為了明星”。
空間轉(zhuǎn)錄組是下一波浪潮
單細(xì)胞技術(shù)在2019年的明星光環(huán)很大程度上歸功于其在空間位置信息層面的技術(shù)突破。
齊煒介紹，單細(xì)胞測(cè)序通常無(wú)法獲取單細(xì)胞的位置信息。“過(guò)去單細(xì)胞測(cè)序要把整個(gè)組織打碎成單個(gè)細(xì)胞的懸液再進(jìn)行處理，這樣就丟失了位置信息，人們無(wú)從得知被測(cè)序的細(xì)胞來(lái)自組織上的哪一位置。”
而在2019年10月，10x Genomics帶著自己的創(chuàng)新Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解決方案成功在納斯達(dá)克上市，超過(guò)50億美金的市值使之毫無(wú)疑問(wèn)地成為全球的單細(xì)胞領(lǐng)頭羊。
Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解決方案將研究重心放到了空間解析的全轉(zhuǎn)錄組mRNA表達(dá)，不僅可從組織切片中獲取細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，還能進(jìn)一步測(cè)獲其轉(zhuǎn)錄本所在的位置信息。
在單細(xì)胞二度摘走《自然》的生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)后，卡羅林斯卡學(xué)院生物學(xué)家 Sten Linnarsson曾如此點(diǎn)評(píng)：“一切都與空間有關(guān)。空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)是單細(xì)胞的下一波浪潮，對(duì)于研究人類疾病的實(shí)驗(yàn)室特別有用，人類疾病通常始于單細(xì)胞并在空間上傳播。”
從邏輯上簡(jiǎn)單解釋，Visium的原理就是在為細(xì)胞加上特有標(biāo)簽序列時(shí)補(bǔ)上了位置信息。更準(zhǔn)確說(shuō)，是給每個(gè)相似細(xì)胞的區(qū)域加上了位置信息。
這一技術(shù)還有待改進(jìn)。齊煒表示，目前單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的精準(zhǔn)度還有待提升。因?yàn)閲?yán)格來(lái)說(shuō)，Visium并沒(méi)有真正達(dá)到單細(xì)胞的水平，而是幾個(gè)細(xì)胞的精度。“如果這一壁壘被突破，那很可能是一個(gè)爆發(fā)級(jí)產(chǎn)品。”她說(shuō)。
李哲認(rèn)為，即便技術(shù)尚未成熟，但Visium的里程碑意義依然毋庸置疑，因?yàn)槠渲赋隽藛渭?xì)胞未來(lái)的發(fā)展方向。時(shí)至今日，單細(xì)胞從“單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組”到“到單細(xì)胞多組學(xué)”和“空間位置信息” 已經(jīng)是一個(gè)明顯趨勢(shì)。
一個(gè)已經(jīng)形成的共識(shí)是，揭示單細(xì)胞實(shí)際的功能狀態(tài)，必須要整合所有層次的證據(jù)，而不僅僅停留在基因表達(dá)層面，當(dāng)下“四處出擊”的多組學(xué)技術(shù)即是出于這一認(rèn)知的產(chǎn)物。而對(duì)于單細(xì)胞而言，回溯其位置信息則是多組學(xué)之外另一個(gè)極其重要的維度。
李哲認(rèn)為，只有把細(xì)胞放回其原來(lái)所處的組織位置再研究才能得到最真實(shí)的結(jié)果，因?yàn)榻M織中細(xì)胞與細(xì)胞之間有著非常多的相互作用。例如腫瘤微環(huán)境，其中有腫瘤細(xì)胞，有健康機(jī)體細(xì)胞，有免疫細(xì)胞、基質(zhì)，還有所有相關(guān)調(diào)控的成分。如果把細(xì)胞分出來(lái)與放到微環(huán)境當(dāng)中去比較，看這些基因在相互作用時(shí)怎么發(fā)揮功能，二者間一定有差別。
“就像一個(gè)人單獨(dú)坐在會(huì)議室中，你觀察他，可能會(huì)覺(jué)得這個(gè)人好像不容易接近，但如果把他放回他自身的朋友圈中，就可能發(fā)現(xiàn)他在自然地跟所有人在愉快交談，是完全不同的狀態(tài)。” 李哲說(shuō)。
以技術(shù)特點(diǎn)對(duì)接應(yīng)用場(chǎng)景
在10x Genomics帶著單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組Visium登陸納斯達(dá)克的同時(shí)，單細(xì)胞測(cè)序在地球另一邊的中國(guó)一片生機(jī)盎然。
2019年，嗅覺(jué)敏銳的投資者已經(jīng)開(kāi)始在國(guó)內(nèi)甄選標(biāo)的。萬(wàn)乘基因、百奧智匯、新格元生物、尋因生物等國(guó)內(nèi)最早一批單細(xì)胞高通量測(cè)序企業(yè)在當(dāng)年陸續(xù)開(kāi)始融資；之后持續(xù)升溫，到2021年，一級(jí)市場(chǎng)已經(jīng)交出了“11家企業(yè)，15筆融資事件”的成績(jī)單，參與者不乏高瓴、紅杉資本、禮來(lái)亞洲基金、IDG資本等明星投資機(jī)構(gòu)。
高瓴對(duì)億歐大健康表示，雖然單細(xì)胞生物經(jīng)歷了前幾年的爆發(fā)，但在下游制藥和臨床應(yīng)用領(lǐng)域，無(wú)論國(guó)內(nèi)外都仍處于早期階段。國(guó)內(nèi)的單細(xì)胞企業(yè)頭部公司還未顯現(xiàn)，而后來(lái)者依然有入場(chǎng)機(jī)會(huì)。
資本總是擁抱創(chuàng)新。如前文所說(shuō)，測(cè)序前的單細(xì)胞捕獲是核心環(huán)節(jié)，雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了高通量操作，但最主流的微流控技術(shù)和微孔板技術(shù)并非完美，學(xué)界對(duì)這一領(lǐng)域的創(chuàng)新其實(shí)也從未間斷。
今年2月，美國(guó)Parse Biosciences剛剛完成超過(guò)4000萬(wàn)美元B輪融資，以尋求將其可實(shí)現(xiàn)超低成本單細(xì)胞建庫(kù)的split-and-pool技術(shù)商業(yè)化；國(guó)內(nèi)德運(yùn)康瑞研發(fā)的Paired-seq技術(shù)能夠突破Cyto-Seq方案的泊松分布限制，雖然只能實(shí)現(xiàn)中通量的單細(xì)胞建庫(kù)，但在臨床穿刺樣本等細(xì)胞量較少的應(yīng)用場(chǎng)景中具備潛在優(yōu)勢(shì)。
在高瓴看來(lái)，單細(xì)胞企業(yè)最重要的不僅是技術(shù)本身的創(chuàng)新性，更是不同企業(yè)能否憑借自身的技術(shù)特點(diǎn)找到最合適的應(yīng)用場(chǎng)景，從而最大化技術(shù)創(chuàng)新的價(jià)值。
值得注意的是，一些單細(xì)胞技術(shù)在近兩年因應(yīng)對(duì)疫情得到了技術(shù)驗(yàn)證。一些企業(yè)將單細(xì)胞測(cè)序用于指導(dǎo)和加速藥物發(fā)現(xiàn)，擺到了投資人的眼前。2020年3月，疫情剛剛在美國(guó)蔓延之際，禮來(lái)與單細(xì)胞測(cè)序公司AbCellera Biologics迅速達(dá)成協(xié)議，共同開(kāi)發(fā)新冠病毒抗體。
AbCellera掌握單B細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，負(fù)責(zé)從新冠康復(fù)患者血清樣本中篩選出高活性的中和抗體。在收到第一批新冠康復(fù)者的血液樣本后的一周內(nèi)，AbCellera迅速篩查了500萬(wàn)以上個(gè)免疫細(xì)胞，來(lái)從中尋找那些幫助患者中和病毒的抗體細(xì)胞。而基于這一協(xié)作誕生的禮來(lái)新冠抗體聯(lián)合療法在2021年的銷售額為22.39億美元。國(guó)內(nèi)方面，丹序生物也與百濟(jì)神州有著同樣的合作。
早前，拜耳和諾華領(lǐng)投的Immunitas也表示在利用單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)挖掘新的靶點(diǎn)，指導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)。不過(guò)作為相對(duì)較新的嘗試，AbCellera和Immunitas證明了單細(xì)胞技術(shù)在有更多應(yīng)用場(chǎng)景值得期待，但疫情已近三年，單細(xì)胞在臨床檢測(cè)上的“啞火”也側(cè)面顯示目前這一技術(shù)距離臨床應(yīng)用可能還有一段路要走。
高瓴認(rèn)為，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)看，臨床應(yīng)用一定是正確的方向，但短期內(nèi)將單細(xì)胞測(cè)序推廣到臨床應(yīng)用確實(shí)難度較大。
究其原因，主要是目前病人單細(xì)胞組學(xué)的數(shù)據(jù)積累不夠，還不足以在單細(xì)胞組學(xué)和疾病進(jìn)展、適用療法、預(yù)后情況等臨床指標(biāo)之間建立起清晰明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。此外，現(xiàn)階段單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)于樣本的新鮮程度，細(xì)胞量也有著嚴(yán)格要求。
多技術(shù)、多學(xué)科的交叉應(yīng)用是單細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的底色，但也對(duì)入局者壘起了更高的壁壘。就目前而言，單細(xì)胞測(cè)序廣闊的前景清晰可測(cè)，而穩(wěn)定的競(jìng)爭(zhēng)格局尚未形成。這一賽道正等待更多的入局者，來(lái)做“難而正確的事”。
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