細胞株構建的核心流程與注意事項及常見問題與解決方案！
小楊 / 2025-04-14 09:23:18
百歐博偉生物：細胞株構建是分子生物學和細胞生物學研究中常用的技術手段，主要用于穩(wěn)定表達特定基因（如熒光蛋白、功能蛋白或shRNA等）的細胞系。以下是其核心流程及注意事項：
一、細胞株構建核心流程
1、實驗設計
選擇宿主細胞：根據(jù)實驗目的選擇適合的細胞系（如HEK293、CHO、HeLa等），需考慮細胞的轉染效率、增殖速度和代謝特性。
目的基因設計：構建目標基因（如過表達、敲除或突變體），需包含啟動子（如CMV強啟動子）、篩選標記（如Puromycin抗性基因、Neomycin抗性基因）及報告基因（如GFP）。
轉染方法選擇：根據(jù)細胞類型選擇脂質(zhì)體轉染、電穿孔、病毒載體（慢病毒/逆轉錄病毒）或CRISPR-Cas9系統(tǒng)。
2、載體構建
克隆目的基因：將目標基因插入表達載體（如pcDNA3.1、pLVX），通過酶切連接、Gibson組裝或CRISPR定向整合。
驗證載體正確性：通過測序、限制性酶切或PCR確認載體結構。
3、轉染
瞬時轉染：快速驗證基因表達（24-72小時），但無法獲得穩(wěn)定細胞株。
穩(wěn)定轉染：
將載體導入宿主細胞，隨后通過抗生素篩選（如Puromycin、G418）富集成功整合外源基因的細胞。
病毒轉染需先包裝病毒顆粒，再感染靶細胞。
4、篩選與單克隆化
抗生素篩選：持續(xù)施加選擇性壓力（通常7-14天），淘汰未轉染的細胞。
單克隆分離：
有限稀釋法：將細胞稀釋至0.5-1個/孔接種于96孔板，確保單克隆來源。
流式分選：利用熒光報告基因（如GFP）分選單細胞。
擴大培養(yǎng)：挑選高表達單克隆擴增至6孔板、培養(yǎng)瓶。
5、驗證
基因組水平：PCR或qPCR檢測外源基因整合。
轉錄水平：RT-qPCR驗證mRNA表達。
蛋白水平：Western blot、免疫熒光或流式細胞術檢測目標蛋白表達。
功能驗證：根據(jù)基因功能設計實驗（如酶活性檢測、細胞表型分析）。
6、擴增與保藏
凍存：將驗證后的細胞株分裝凍存于液氮（含10% DMSO的凍存液）。
穩(wěn)定性檢測：連續(xù)傳代（如10代以上）后檢測基因表達是否穩(wěn)定。
7、表型鑒定（可選）
根據(jù)研究目的進行功能分析（如增殖、遷移、凋亡、代謝通路變化等）。
二、常見問題與解決方案
三、注意事項
嚴格無菌操作：避免支原體污染（定期檢測）。
單克隆驗證：務必確保單克隆來源，避免混合細胞干擾結果。
對照設置：包括空載體對照、未轉染細胞對照及抗生素殺傷曲線實驗。
長期穩(wěn)定性：定期復蘇凍存細胞驗證表達一致性。
四、應用場景
基因功能研究（過表達/敲除）
藥物靶點篩選
蛋白生產(chǎn)（如CHO細胞生產(chǎn)抗體）
疾病模型構建（如腫瘤耐藥株）
通過上述流程，可獲得穩(wěn)定、均一的目標細胞株，為后續(xù)研究提供可靠工具。
北京百歐博偉生物技術有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！