生物制品安全性中支原體污染檢測的核心要求與方法詳解！
小楊 / 2025-06-17 09:58:45
百歐博偉生物：生物制品（包括疫苗、單克隆抗體、細胞治療產(chǎn)品、基因治療產(chǎn)品等）的安全性至關(guān)重要，其中支原體污染是生產(chǎn)過程中需要嚴格監(jiān)控的關(guān)鍵風險之一。支原體污染可能源自細胞庫、原材料、操作人員或環(huán)境，其危害巨大且檢測具有一定挑戰(zhàn)性。以下是對生物制品支原體污染檢測的詳解：
一、為什么支原體污染如此危險？
1、難以察覺：
體積微?。褐гw是最小的可自我復(fù)制的原核生物（0.2-0.3 µm），光學(xué)顯微鏡下難以直接觀察。
無細胞壁：對作用于細胞壁的抗生素（如青霉素）天然耐藥，常規(guī)抗生素預(yù)防無效。
低水平污染：初期污染可能不引起明顯的細胞病變效應(yīng)或培養(yǎng)液渾濁，容易被忽視。
2、危害嚴重：
影響細胞功能：支原體寄生在細胞表面或內(nèi)部，競爭性消耗營養(yǎng)物質(zhì)，改變細胞代謝，誘導(dǎo)或抑制基因表達，導(dǎo)致細胞生長緩慢、形態(tài)改變、染色體異常、代謝產(chǎn)物改變、細胞凋亡等。
干擾實驗結(jié)果：在研發(fā)階段，污染會導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不可靠、結(jié)果無法重復(fù)。
改變產(chǎn)品特性：在生物制品生產(chǎn)中，污染會改變目標蛋白的表達、糖基化模式，或影響病毒載體的產(chǎn)量和感染性。
潛在安全隱患：終產(chǎn)品中殘留的支原體或其成分可能引發(fā)患者嚴重的免疫反應(yīng)、發(fā)熱、器官損傷甚至膿毒癥等不良反應(yīng)。細胞治療產(chǎn)品中的活支原體可能直接感染患者。
3、傳播性強：通過氣溶膠、操作人員、污染的試劑或培養(yǎng)基、共用設(shè)備等途徑極易在實驗室或生產(chǎn)車間內(nèi)擴散。
二、支原體污染檢測的核心要求
高靈敏度：必須能檢測到極低水平的污染（法規(guī)通常要求能檢測到 ≤ 10 CFU/mL 的污染）。
高特異性：準確識別支原體，避免與其他微生物或細胞成分混淆導(dǎo)致假陽性或假陰性。
廣譜性：能檢測多種可能污染細胞培養(yǎng)的支原體物種（常見的有幾十種）。
可靠性：結(jié)果穩(wěn)定、可重復(fù)。
法規(guī)符合性：必須符合各國藥典（如中國藥典ChP、美國藥典USP、歐洲藥典EP、日本藥典JP）和國際指南的要求。
三、主要的支原體檢測方法詳解
檢測方法主要分為兩大類：基于培養(yǎng)的方法和非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法。通常需要結(jié)合使用以滿足法規(guī)的全面性要求。
(一) 基于培養(yǎng)的方法 - “金標準”
1、液體培養(yǎng)基培養(yǎng) & 瓊脂平板培養(yǎng)法：
原理：將待測樣品接種到富含營養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，支原體生長代謝會改變培養(yǎng)基的pH（酚紅指示劑變色）。陽性培養(yǎng)物需進一步轉(zhuǎn)種到瓊脂平板上，在微需氧或厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，觀察特征性“煎蛋”樣菌落。
樣品：待檢生物制品或其代表物（如收獲液、未加防腐劑的半成品或成品）、細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解液、主/工作細胞庫。
培養(yǎng)基：使用經(jīng)驗證、支持多種支原體生長的復(fù)合培養(yǎng)基，通常包含血清、酵母提取物、精氨酸/葡萄糖等。
指示細胞：通常需要同時接種Vero細胞或其他易感細胞系（作為指示細胞）進行共培養(yǎng)，以放大可能存在的低水平污染。
培養(yǎng)時間：至少14天（EP要求培養(yǎng)至第28天觀察），需頻繁觀察。
陽性對照：需同時接種低濃度（≤ 100 CFU/mL）的標準支原體株。
陰性對照：培養(yǎng)基對照。
優(yōu)點：是藥典規(guī)定的法定方法，能檢測活的、可培養(yǎng)的支原體，靈敏度高（理論上可檢測1個CFU），特異性強（看到菌落），廣譜性好。
缺點：耗時長（14-28天），操作繁瑣（需多次傳代、染色、鏡檢），需要熟練技術(shù)人員判斷結(jié)果，部分支原體在無細胞培養(yǎng)基中生長緩慢或困難，需依賴指示細胞法補充。
2、指示細胞培養(yǎng)法結(jié)合DNA熒光染色法：
原理：將待測樣品接種到貼壁生長的指示細胞上，共培養(yǎng)3-5天，使支原體在細胞表面增殖。固定細胞后，用特異性結(jié)合DNA的熒光染料染色，在熒光顯微鏡下觀察。支原體DNA會在真核細胞核周圍呈現(xiàn)點狀或絲狀熒光。
樣品：同液體/瓊脂培養(yǎng)法。
培養(yǎng)時間：通常3-5天。
優(yōu)點：比液體/瓊脂培養(yǎng)法快，能檢測依賴細胞生長的支原體，靈敏度高（可檢測低至100-1000 CFU/mL），顯微鏡下可直觀看到支原體與細胞的關(guān)聯(lián)。
缺點：需要熒光顯微鏡和有經(jīng)驗的技術(shù)人員判讀，存在主觀性，染色背景可能干擾（如細胞碎片、死細胞、其他微生物），對非細胞依賴性支原體的靈敏度可能不如液體培養(yǎng)法。通常作為液體/瓊脂培養(yǎng)法的補充或替代（需驗證）。
(二) 非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法 - 快速、主流
1、核酸擴增技術(shù)：是目前應(yīng)用最廣泛、速度最快的檢測方法，特別是用于過程控制和放行檢測。
通用PCR：
原理：利用針對支原體高度保守的16S rRNA基因或16S-23S rRNA基因間隔區(qū)設(shè)計的通用引物，對待測樣品DNA進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳觀察條帶，或進行測序確認。
優(yōu)點：快速（數(shù)小時），靈敏度高（理論上可檢測幾個基因組拷貝），特異性較好。
缺點：無法區(qū)分死活菌，存在假陽性（污染、引物二聚體）和假陰性（抑制劑）風險，凝膠電泳靈敏度有限，廣譜性依賴于引物設(shè)計（需覆蓋常見污染菌種）。
實時熒光定量PCR：
原理：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標記的探針，實時監(jiān)測擴增過程中熒光信號的積累，實現(xiàn)定量或定性檢測。是目前最主流的快速檢測方法。
優(yōu)點：極其快速（通常2-4小時），靈敏度極高（可檢測低至個位數(shù)基因組拷貝），特異性極強（探針增加了特異性），可定量（評估污染水平），閉管操作減少污染風險，自動化程度高。
缺點：設(shè)備成本高，無法區(qū)分死活菌，對樣品中PCR抑制物敏感，引物/探針設(shè)計需要非常嚴謹以確保廣譜性。
多重PCR/qPCR：可同時檢測多種特定支原體物種或包含內(nèi)標以監(jiān)控PCR抑制。
等溫擴增技術(shù)：如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，操作更簡單，無需熱循環(huán)儀，但應(yīng)用不如qPCR廣泛。
2、新一代測序：
原理：對樣品總DNA進行高通量測序，通過生物信息學(xué)分析比對微生物數(shù)據(jù)庫，理論上可無偏倚地檢測所有已知甚至未知的微生物（包括支原體）。
優(yōu)點：無需預(yù)設(shè)目標，可提供物種信息，靈敏度高。
缺點：成本高，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，耗時相對較長（數(shù)天），對背景微生物DNA敏感，難以精確定量，法規(guī)認可度仍在發(fā)展中，目前更多用于調(diào)查性檢測或特殊研究。
(三) 酶學(xué)法
原理：檢測支原體特有的酶活性。試劑與樣品混合后，通過生物發(fā)光信號的變化判斷是否存在支原體。
優(yōu)點：快速（約20分鐘），操作簡單，可半定量。
缺點：廣譜性存疑（并非所有支原體都表達高水平的該酶），靈敏度可能不如qPCR和培養(yǎng)法，存在假陽性/假陰性風險（受細胞狀態(tài)、樣品成分影響），通常不被藥典認可作為放行檢測的唯一方法，多用于過程監(jiān)控或初步篩查。
四、法規(guī)要求與檢測策略
藥典規(guī)定：主要藥典（ChP, USP, EP, JP）均明確規(guī)定生物制品（特別是來源于細胞培養(yǎng)的產(chǎn)品）在其生產(chǎn)和放行過程中必須進行支原體檢測。
檢測對象：主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、病毒收獲液、未加防腐劑的半成品/成品等關(guān)鍵階段樣品。
方法選擇與組合：
放行檢測：通常要求使用兩種不同原理的方法，其中一種必須是基于培養(yǎng)的方法（液體/瓊脂培養(yǎng)法或指示細胞法）。qPCR因其快速、靈敏、特異，已成為另一種常用方法（需經(jīng)過充分驗證）。
過程控制/中間品檢測：主要采用快速方法，用于及時監(jiān)控生產(chǎn)過程中的污染風險，指導(dǎo)生產(chǎn)決策。
驗證：任何用于放行檢測的方法（尤其是NAT方法）都必須按照GMP/GLP要求進行嚴格的方法學(xué)驗證，包括：
特異性：檢測目標支原體而不與非目標微生物/細胞DNA交叉反應(yīng)。
靈敏度/檢測限：確定能可靠檢出的最低污染水平（通常≤10 CFU/mL或等效基因組拷貝數(shù)）。
耐用性：方法對微小變異的承受能力（如試劑批次、操作人員、儀器）。
準確性：與藥典方法（培養(yǎng)法）的等效性研究。
精密度：重復(fù)性和中間精密度。
抑制試驗：證明在樣品基質(zhì)存在下仍能有效檢測低水平污染（通常加入內(nèi)標監(jiān)控）。
樣品處理：對于可能含有支原體抑制物的樣品（如含血清、抗生素、細胞碎片的產(chǎn)品），需要進行適當處理，如濃縮、稀釋、過濾、DNA提取純化等，以提高檢測靈敏度并去除抑制劑。處理過程本身不能引入污染或損失目標支原體。
五、關(guān)鍵挑戰(zhàn)與注意事項
死活菌區(qū)分：NAT方法無法區(qū)分死活菌，陽性結(jié)果可能來自死菌殘留的DNA。培養(yǎng)法是檢測活菌的“金標準”。在調(diào)查污染來源和評估風險時需考慮此點。
廣譜性驗證：確保所選方法（特別是引物/探針）能有效覆蓋所有常見的、可能造成污染的支原體物種。
PCR抑制：樣品中的復(fù)雜成分（如血紅蛋白、肝素、某些培養(yǎng)基成分、高濃度DNA）可能抑制PCR反應(yīng)，導(dǎo)致假陰性。必須使用內(nèi)標監(jiān)控每個樣品的擴增效率。
污染控制：支原體檢測實驗室本身必須嚴格防止交叉污染（尤其是NAT實驗室），需分區(qū)操作，使用帶濾芯的吸頭，嚴格遵循操作規(guī)范。
人員培訓(xùn)與經(jīng)驗：判讀結(jié)果（尤其是培養(yǎng)法和指示細胞法）需要經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員。
趨勢分析與調(diào)查：建立檢測數(shù)據(jù)庫，進行趨勢分析。一旦發(fā)現(xiàn)陽性或可疑結(jié)果，必須啟動徹底的偏差調(diào)查，追溯污染源，評估對產(chǎn)品的影響，并采取糾正預(yù)防措施。
總結(jié)
支原體污染是生物制品安全的重大威脅。其檢測需要綜合運用基于培養(yǎng)的“金標準”方法（滿足法規(guī)廣譜性和活菌檢測要求）和快速、高靈敏的分子生物學(xué)方法。嚴格遵守藥典規(guī)定，進行嚴謹?shù)姆椒炞C和樣品處理，實施嚴格的實驗室污染控制，并結(jié)合專業(yè)的人員判讀和科學(xué)的趨勢分析/偏差調(diào)查，是確保生物制品免受支原體污染、保障患者安全的基石。隨著技術(shù)發(fā)展，qPCR等分子方法的應(yīng)用日益廣泛和成熟，但基于培養(yǎng)的方法因其檢測活菌的不可替代性，在法規(guī)放行檢測中仍占據(jù)核心地位。
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