乳酸菌檢驗(yàn)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的影響因素與核心控制及操作流程！
小楊 / 2025-08-06 10:16:28
百歐博偉生物：乳酸菌檢驗(yàn)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性直接影響對樣品中乳酸菌數(shù)量的判斷（如發(fā)酵食品品質(zhì)、益生菌產(chǎn)品活性等），其結(jié)果受樣品處理、操作流程、培養(yǎng)條件等多個(gè)環(huán)節(jié)影響。以下從關(guān)鍵環(huán)節(jié)拆解影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的核心因素，并說明具體影響機(jī)制：
一、樣品本身及預(yù)處理因素
樣品的初始狀態(tài)和預(yù)處理方式是計(jì)數(shù)的“起點(diǎn)”，直接決定后續(xù)操作的基礎(chǔ)是否可靠。
1、樣品新鮮度與儲存條件
乳酸菌（尤其是活菌）對環(huán)境敏感，若樣品儲存不當(dāng)（如溫度過高、儲存時(shí)間過長），會導(dǎo)致乳酸菌自然死亡或增殖（如發(fā)酵初期樣品），使原始菌數(shù)偏離真實(shí)值。例如：冷藏的酸奶若室溫放置超過 2 小時(shí)，乳酸菌可能因溫度升高加速代謝死亡；
樣品若存在腐敗、污染（如混入大量雜菌），可能釋放抑菌物質(zhì)（如某些腐敗菌的代謝產(chǎn)物），抑制乳酸菌生長，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。
2、樣品勻質(zhì)與分散效果
乳酸菌可能在樣品中呈聚集狀態(tài)（如在發(fā)酵乳中因蛋白網(wǎng)絡(luò)包裹形成菌團(tuán)），若勻質(zhì)不充分（如未用均質(zhì)器處理、勻質(zhì)時(shí)間不足），會導(dǎo)致菌團(tuán)未分散，單個(gè)菌落可能對應(yīng)多個(gè)菌體，最終計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。
對于固體 / 半固體樣品（如奶酪、泡菜），若未按標(biāo)準(zhǔn)比例加入稀釋液（如 1:9 無菌生理鹽水）、未充分研磨或攪拌，會導(dǎo)致樣品無法均勻分散，后續(xù)稀釋液中菌濃度不均，接種后菌落數(shù)差異極大。
二、稀釋與接種操作因素
稀釋和接種是將樣品中乳酸菌“定量傳遞”到培養(yǎng)基的關(guān)鍵步驟，操作不規(guī)范會直接導(dǎo)致菌數(shù)傳遞偏差。
1、稀釋液選擇與制備
稀釋液需滿足“不損傷乳酸菌、維持滲透壓”的要求（常用無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液或 0.1% 蛋白胨水）。若稀釋液滲透壓過高（如未稀釋的生理鹽水）或含抑菌成分（如殘留消毒劑），會導(dǎo)致乳酸菌在稀釋過程中死亡，計(jì)數(shù)偏低；
稀釋液未滅菌或滅菌不徹底（如污染雜菌），會引入外源菌，與乳酸菌競爭生長，甚至掩蓋乳酸菌菌落，導(dǎo)致“假陽性計(jì)數(shù)”（偏高）。
2、稀釋過程的均一性
稀釋時(shí)若未嚴(yán)格遵循“每級稀釋后充分混勻”（如未用渦旋振蕩器振蕩、僅簡單搖晃），會導(dǎo)致稀釋液中菌濃度分布不均：高濃度區(qū)域接種后菌落過密，低濃度區(qū)域菌落稀疏，最終計(jì)數(shù)結(jié)果波動(dòng)極大（同一稀釋度平行樣差異超過允許范圍）；
稀釋倍數(shù)計(jì)算錯(cuò)誤（如誤將 1:10 稀釋操作為 1:100）或吸管使用不當(dāng)（如未使用刻度準(zhǔn)確的移液管、移液時(shí)殘留液體未完全釋放），會直接導(dǎo)致稀釋倍數(shù)偏差，最終結(jié)果成比例偏離真實(shí)值。
3、接種量與操作規(guī)范性
接種量需精準(zhǔn)（常用 0.1mL 或 1mL 涂布 / 傾注），若接種量誤差過大（如實(shí)際接種 0.08mL 卻按 0.1mL 計(jì)算），會導(dǎo)致最終計(jì)數(shù)結(jié)果（菌落數(shù) / 接種量 × 稀釋倍數(shù)）偏高或偏低；
涂布接種時(shí)若培養(yǎng)基未凝固就涂布，會導(dǎo)致菌液滲入培養(yǎng)基深層，菌落難以長出；傾注接種時(shí)若培養(yǎng)基溫度過高（如超過 50℃），會直接燙死乳酸菌，導(dǎo)致菌落數(shù)驟減（嚴(yán)重時(shí)為 0）。
三、培養(yǎng)基與試劑因素
乳酸菌對營養(yǎng)和環(huán)境敏感，培養(yǎng)基的“適配性”直接決定其能否正常生長形成可見菌落。
1、培養(yǎng)基營養(yǎng)與配方適配性
乳酸菌為化能異養(yǎng)菌，需特定碳源（如葡萄糖、乳糖）、氮源（如蛋白胨、酵母浸粉）及生長因子（如維生素、氨基酸）。若培養(yǎng)基營養(yǎng)不足（如酵母浸粉添加量不夠）或碳源不適（如某些乳酸菌不能利用蔗糖，卻用蔗糖作為唯一碳源），會導(dǎo)致乳酸菌生長緩慢或無法形成可見菌落，計(jì)數(shù)偏低；
培養(yǎng)基 pH 需適配乳酸菌生長（多數(shù)乳酸菌最適 pH 6.0-7.0，發(fā)酵型可能耐受更低 pH）。若 pH 過高（如未調(diào) pH 導(dǎo)致堿性）或過低，會抑制乳酸菌增殖，菌落小且少，甚至無法計(jì)數(shù)。
2、培養(yǎng)基滅菌與儲存
滅菌過度（如高壓蒸汽滅菌時(shí)間過長、溫度過高）會破壞培養(yǎng)基中的熱敏成分（如維生素、某些氨基酸），導(dǎo)致營養(yǎng)失效；滅菌不徹底則會污染雜菌（如
芽孢桿菌、
酵母菌），雜菌菌落可能與乳酸菌菌落形態(tài)相似（如圓形、乳白色），導(dǎo)致誤判為乳酸菌（計(jì)數(shù)偏高）；
培養(yǎng)基儲存不當(dāng)（如開封后未冷藏、儲存時(shí)間過長）會吸濕結(jié)塊或污染，使用時(shí)無法均勻溶解，或引入雜菌，影響菌落生長和判斷。
四、培養(yǎng)條件因素
乳酸菌的生長依賴嚴(yán)格的溫度、氧氣、時(shí)間等環(huán)境條件，任何一項(xiàng)偏離都會導(dǎo)致菌落生長異常。
1、培養(yǎng)溫度與時(shí)間
不同乳酸菌最適生長溫度不同：乳桿菌屬多為 30-37℃，鏈球菌屬多為 35-39℃。若溫度偏離（如將乳桿菌置于 40℃培養(yǎng)），會導(dǎo)致生長速率下降，培養(yǎng)相同時(shí)間后菌落未成熟（過小或不可見），計(jì)數(shù)偏低；
培養(yǎng)時(shí)間不足（如標(biāo)準(zhǔn)要求 48-72 小時(shí)，卻僅培養(yǎng) 24 小時(shí)），乳酸菌未充分增殖形成可見菌落；時(shí)間過長則可能導(dǎo)致菌落過度生長、融合（尤其高濃度稀釋度），無法區(qū)分單個(gè)菌落（少計(jì)），或雜菌大量繁殖掩蓋目標(biāo)菌落。
2、氧氣環(huán)境控制
乳酸菌多數(shù)為兼性厭氧或微需氧（少數(shù)為嚴(yán)格厭氧，如
雙歧桿菌）。若培養(yǎng)時(shí)氧氣濃度過高（如未用厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋，直接暴露于空氣中），會抑制厭氧型乳酸菌生長（如雙歧桿菌無法形成菌落），導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果僅反映需氧 / 兼性厭氧菌株，遺漏厭氧菌株（整體偏低）；
厭氧環(huán)境控制不當(dāng)（如厭氧袋失效、培養(yǎng)容器密封不嚴(yán)），氧氣殘留會導(dǎo)致部分乳酸菌生長受阻，菌落數(shù)量減少。
五、計(jì)數(shù)操作與判斷因素
計(jì)數(shù)是結(jié)果輸出的最后一步，主觀判斷和操作規(guī)范直接影響最終數(shù)值。
1、菌落形態(tài)判斷準(zhǔn)確性
乳酸菌菌落多為圓形、邊緣整齊、乳白色或淺黃，表面光滑；但樣品中若存在雜菌（如污染的
微球菌、
酵母菌），可能形成形態(tài)相似的菌落，若計(jì)數(shù)時(shí)未區(qū)分（如誤將酵母菌菌落計(jì)入），會導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏高；
部分乳酸菌因生長緩慢，菌落極?。ㄈ缒承┤榍蚓?，若計(jì)數(shù)時(shí)未注意觀察（漏計(jì)小菌落），會導(dǎo)致結(jié)果偏低。
2、計(jì)數(shù)范圍選擇
標(biāo)準(zhǔn)要求選擇菌落數(shù)在30-300 個(gè)的平板計(jì)數(shù)（此范圍菌落分布均勻，計(jì)數(shù)誤差?。?。若選擇菌落數(shù)＜30 的平板（誤差率＞10%）或＞300 的平板（菌落重疊、難以區(qū)分），會導(dǎo)致結(jié)果偏差；
同一稀釋度平行平板間菌落數(shù)差異過大（如超過 1 倍），未按標(biāo)準(zhǔn)舍棄異常平板（如因操作污染導(dǎo)致的菌落驟增），直接取平均值會引入誤差。
3、計(jì)數(shù)人員操作規(guī)范性
計(jì)數(shù)時(shí)未按“蛇形路線”逐格計(jì)數(shù)，漏計(jì)邊緣或角落菌落；或?qū)θ诤暇洌ㄈ?2 個(gè)菌落相鄰）未按“單個(gè)菌落”判斷（多計(jì)）；
未使用 Colony Counter（菌落計(jì)數(shù)器）等工具，僅憑肉眼估算，導(dǎo)致主觀誤差（尤其菌落密集時(shí)）。
六、器具與環(huán)境因素
無菌環(huán)境和合格器具是避免“外源干擾”的基礎(chǔ)。
1、器具無菌性
培養(yǎng)皿、移液管、試管等未徹底滅菌（如殘留芽孢），會引入雜菌污染培養(yǎng)基，雜菌菌落與乳酸菌混淆，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏高；
器具清洗不徹底（如殘留洗滌劑），會釋放抑菌物質(zhì)，抑制乳酸菌生長，導(dǎo)致菌落數(shù)減少。
2、操作環(huán)境潔凈度
在非無菌環(huán)境（如未消毒的超凈臺、開放工作臺）操作，空氣中的雜菌（如
霉菌、
芽孢桿菌）會落入培養(yǎng)基，污染平板，干擾計(jì)數(shù)；
操作人員手部、衣物未消毒，或操作時(shí)說話、咳嗽，會引入外源菌，導(dǎo)致污染。
七、總結(jié)：核心控制邏輯
乳酸菌計(jì)數(shù)的核心是“讓樣品中所有活菌均能在培養(yǎng)基上形成可識別的單個(gè)菌落，并被準(zhǔn)確計(jì)數(shù)”。因此，需從“樣品保真→菌液均一傳遞→菌落正常生長→準(zhǔn)確識別計(jì)數(shù)”全流程控制：
樣品需新鮮、勻質(zhì)充分；
稀釋、接種需嚴(yán)格無菌、規(guī)范操作；
培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件需適配目標(biāo)乳酸菌；
計(jì)數(shù)時(shí)嚴(yán)格區(qū)分目標(biāo)菌落、選擇合理平板。
通過控制上述因素，可將計(jì)數(shù)誤差控制在標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)（一般平行樣相對偏差≤10%），確保結(jié)果可靠。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇?，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：MSCs與免疫系統(tǒng)的博弈：NK細(xì)胞殺傷為何不影響治療效果？
下一篇：真空包裝食品出現(xiàn)脹袋的核心誘因與應(yīng)對措施及解決方案！