微生物實驗時平板接種菌之后沒有菌落生長怎么辦？
小楊 / 2025-08-14 10:15:01
百歐博偉生物：在微生物實驗中，平板接種后未觀察到菌落生長是常見問題，可能由操作失誤、材料問題或環(huán)境條件不當(dāng)?shù)榷喾N原因?qū)е?。以下從可能原因、排查方法和解決措施三方面進(jìn)行詳細(xì)分析，幫助逐步定位問題：
一、接種物（菌種）相關(guān)問題
接種物是菌落生長的基礎(chǔ)，若菌種本身存在問題，會直接導(dǎo)致無菌落。
1、菌種失活
可能原因：菌種保存不當(dāng)（如冷凍溫度過高、反復(fù)凍融、斜面菌種老化超過保質(zhì)期）、傳代過程中污染雜菌導(dǎo)致目標(biāo)菌被抑制。
排查方法：
檢查菌種保存記錄，確認(rèn)是否在有效期內(nèi)（如斜面菌種通常 4℃保存不超過 1 個月，-80℃冷凍保存需加保護(hù)劑）。
取原始儲備菌種重新接種，觀察是否生長（排除傳代過程中失活的可能）。
解決措施：
規(guī)范菌種保存：短期用斜面 4℃保存，長期用甘油管 - 80℃冷凍（甘油終濃度 15%-20%），避免反復(fù)凍融。
定期傳代（如每月 1 次），確保菌種活性。
2、接種量不足或未接種成功
可能原因：接種環(huán) / 針未蘸取到菌種（如液體菌種濃度過低、固體菌種挑取時未刮到菌體）、接種時菌液滴落或操作失誤導(dǎo)致未轉(zhuǎn)移到平板。
排查方法：
觀察接種工具：接種環(huán)蘸取液體菌種后應(yīng)有明顯渾濁液滴，挑取固體菌種后可見少量菌苔。
重新接種時增加接種量（如液體菌種取 0.1-0.2mL 涂布，固體菌種多挑取一點菌苔）。
解決措施：
液體菌種可先測 OD 值（如
大腸桿菌 OD600≈0.5 時濃度約 10^8 CFU/mL），確保濃度合適。
接種時動作規(guī)范：涂布法需將菌液均勻涂滿平板表面，劃線法確保每一區(qū)都與上一區(qū)交叉以獲得單菌落。
二、培養(yǎng)基相關(guān)問題
培養(yǎng)基是微生物生長的營養(yǎng)來源，若培養(yǎng)基制備或處理不當(dāng)，會抑制菌落生長。
1、培養(yǎng)基滅菌不徹底或被污染
可能原因：高壓蒸汽滅菌參數(shù)錯誤（如壓力不足、時間不夠）、滅菌后未及時使用導(dǎo)致二次污染（如平板開蓋暴露時間過長）。
排查方法：
檢查滅菌記錄：確認(rèn)滅菌溫度（121℃）、壓力（0.1MPa）、時間（15-30 分鐘，根據(jù)培養(yǎng)基體積調(diào)整）是否符合標(biāo)準(zhǔn)。
觀察空白平板：將未接種的同批次平板同條件培養(yǎng)，若出現(xiàn)雜菌，說明培養(yǎng)基滅菌失敗或污染。
解決措施：
嚴(yán)格滅菌操作：滅菌前檢查滅菌器壓力表、溫度傳感器是否正常，滅菌后待壓力降至 0 再開蓋。
平板制備后及時使用，暫存需倒置 4℃保存，避免超過 1 周。
2、培養(yǎng)基成分或 pH 不合適
可能原因：配方錯誤（如漏加關(guān)鍵營養(yǎng)成分，如氨基酸、生長因子）、pH 偏離目標(biāo)菌適宜范圍（如細(xì)菌通常 pH 7.0-7.4，真菌 pH 5.0-6.0）、添加了抑制劑（如抗生素對敏感菌的抑制）。
排查方法：
核對培養(yǎng)基配方：確認(rèn)是否按比例添加成分（如 LB 培養(yǎng)基需胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl）。
檢測 pH：用 pH 計測量未滅菌的培養(yǎng)基，或觀察培養(yǎng)基顏色（如含酚紅的培養(yǎng)基，酸性呈黃色，堿性呈紅色）。
確認(rèn)是否誤加抑制劑（如篩選抗性菌時加了抗生素，但目標(biāo)菌無抗性）。
解決措施：
嚴(yán)格按照配方稱量，滅菌前調(diào)整 pH 至適宜范圍。
若需添加敏感成分（如抗生素、維生素），待培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃時再加入（避免高溫破壞）。
3、培養(yǎng)基凝固不良
可能原因：瓊脂添加量不足（通常 1.5%-2%）、滅菌時溫度過高導(dǎo)致瓊脂分解、倒平板時溫度過低導(dǎo)致凝固不均。
排查方法：觀察平板是否凝固（傾斜平板無流動），觸摸是否有彈性。
解決措施：按配方添加瓊脂，滅菌時間不超過 30 分鐘（避免瓊脂降解），倒平板時待培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃（手感微燙但不燙手）。
三、培養(yǎng)條件相關(guān)問題
即使接種物和培養(yǎng)基正常，培養(yǎng)環(huán)境不適也會導(dǎo)致無菌落。
1、溫度不當(dāng)
可能原因：培養(yǎng)溫度偏離目標(biāo)菌最適溫度（如
大腸桿菌 37℃，乳酸菌 30℃，真菌 28℃）。
排查方法：檢查培養(yǎng)箱溫度顯示，用溫度計校準(zhǔn)實際溫度（避免培養(yǎng)箱故障導(dǎo)致溫度偏差）。
解決措施：根據(jù)菌種特性設(shè)置溫度（如嗜熱菌需 45-55℃，嗜冷菌需 10-15℃），定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱。
2、氣體環(huán)境錯誤
可能原因：需氧菌在厭氧環(huán)境中培養(yǎng)（如
大腸桿菌需有氧）、厭氧菌在有氧環(huán)境中培養(yǎng)（如破傷風(fēng)梭菌需厭氧）。
排查方法：
確認(rèn)菌種呼吸類型：需氧菌可在普通培養(yǎng)箱生長，厭氧菌需厭氧罐（加厭氧袋）或厭氧工作站。
檢查厭氧環(huán)境是否有效：厭氧袋是否產(chǎn)氣（如美藍(lán)指示劑厭氧條件下呈白色，有氧呈藍(lán)色）。
解決措施：
需氧菌：普通培養(yǎng)箱（靜置或搖床震蕩增加溶氧）。
厭氧菌：使用厭氧罐，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋（如含亞硫酸鈉的袋子），并密封確保無氧。
3、培養(yǎng)時間不足
可能原因：部分生長緩慢的菌種（如
分枝桿菌、真菌）需要更長時間（細(xì)菌通常 1-2 天，真菌 3-7 天，分枝桿菌需 2-4 周）。
排查方法：延長培養(yǎng)時間（如細(xì)菌培養(yǎng) 48 小時，真菌培養(yǎng) 7 天）后觀察。
解決措施：根據(jù)菌種特性設(shè)置培養(yǎng)時間，生長緩慢的菌種需標(biāo)記并延長培養(yǎng)。
四、操作過程污染或干擾
操作不規(guī)范可能引入抑制劑或?qū)е码s菌競爭，抑制目標(biāo)菌生長。
1、接種工具滅菌不當(dāng)
可能原因：接種環(huán) / 針滅菌不徹底（如灼燒后未冷卻，燙死菌種；或滅菌后觸碰污染物）。
排查方法：觀察接種環(huán)灼燒后是否完全紅熱（確保滅菌），冷卻時是否接觸桌面或其他物品。
解決措施：
接種環(huán)滅菌：灼燒至紅熱后，在無菌瓊脂邊緣冷卻 3-5 秒（避免燙死菌種）。
滅菌后避免觸碰任何非無菌表面。
2、雜菌污染抑制目標(biāo)菌
可能原因：操作環(huán)境（超凈臺）污染、手或?qū)嶒灧廴?，?dǎo)致雜菌大量繁殖并抑制目標(biāo)菌。
排查方法：觀察平板是否有異常菌落（如顏色、形態(tài)與目標(biāo)菌不同），或空白平板是否污染。
解決措施：
操作前紫外消毒超凈臺 30 分鐘，用 75% 酒精擦拭臺面和雙手。
接種時避免說話、咳嗽，減少空氣流動干擾。
五、系統(tǒng)排查建議
若以上單一原因未找到問題，可按以下步驟系統(tǒng)排查：
對照實驗：用已知活性的標(biāo)準(zhǔn)菌種（如實驗室保存的
大腸桿菌 ATCC 25922）接種同批次平板，同條件培養(yǎng)。若標(biāo)準(zhǔn)菌種生長，說明問題在原始菌種；若不生長，說明問題在培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。
重復(fù)操作：嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程重新接種（更換菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件），排除偶然操作失誤。
分步驗證：分別驗證“菌種活性”（接種液體培養(yǎng)基觀察渾濁度）、“培養(yǎng)基有效性”（接種標(biāo)準(zhǔn)菌）、“培養(yǎng)條件”（用溫度計和厭氧指示劑確認(rèn)）。
通過以上排查，通常能找到無菌落生長的原因。關(guān)鍵是規(guī)范操作流程，做好實驗記錄（如菌種來源、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件等），以便快速定位問題。
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