實(shí)驗(yàn)室常見的基于分子生物學(xué)檢測方法分類及詳細(xì)介紹！
小楊 / 2025-08-22 09:24:35
百歐博偉生物：基于分子生物學(xué)的檢測方法是利用核酸（DNA 或 RNA）的特性，通過分析基因序列、結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)檢測目的的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于微生物鑒定、疾病診斷、基因分型等領(lǐng)域。以下是常見的基于分子生物學(xué)的檢測方法分類及詳細(xì)介紹：
一、核酸擴(kuò)增技術(shù)
通過體外大量擴(kuò)增目標(biāo)核酸片段，提高檢測靈敏度，是分子生物學(xué)檢測中最核心的技術(shù)之一。
1、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）
原理：在 DNA 聚合酶催化下，以目的基因兩端的特異性引物為起點(diǎn)，通過變性（DNA 解鏈）、退火（引物結(jié)合）、延伸（合成子鏈）三個步驟循環(huán)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo) DNA 的指數(shù)級擴(kuò)增。
應(yīng)用：檢測特定基因（如
葡萄球菌表面抗原的編碼基因）、微生物鑒定、基因突變分析等。
特點(diǎn)：靈敏度高（可檢測單拷貝基因），但擴(kuò)增產(chǎn)物需通過電泳等方式驗(yàn)證，易受污染導(dǎo)致假陽性。
2、實(shí)時熒光定量 PCR（qPCR）
原理：在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過檢測每次循環(huán)的熒光強(qiáng)度，實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，實(shí)現(xiàn)定量分析。
應(yīng)用：基因表達(dá)量分析、病原體定量檢測、拷貝數(shù)變異研究等。
特點(diǎn)：無需后續(xù)電泳，可實(shí)時定量，特異性和靈敏度優(yōu)于常規(guī) PCR。
3、多重 PCR
原理：在同一反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，同時擴(kuò)增多個目標(biāo) DNA 片段，通過片段大小差異區(qū)分不同靶標(biāo)。
應(yīng)用：多基因同時檢測（如細(xì)菌毒力基因、耐藥基因組合檢測）、基因分型等。
特點(diǎn)：高效快捷，節(jié)省樣本和試劑，但引物設(shè)計(jì)需避免交叉干擾。
4、巢式 PCR
原理：分兩輪 PCR 擴(kuò)增，第一輪用外側(cè)引物擴(kuò)增獲得較大片段，第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板，用內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增更特異的片段。
應(yīng)用：檢測低豐度或復(fù)雜背景中的目標(biāo)基因。
特點(diǎn)：特異性和靈敏度極高，降低非特異性擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)。
5、逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）
原理：先以 RNA 為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用于檢測 RNA（如 mRNA、病毒 RNA）。
應(yīng)用：基因表達(dá)分析（檢測 mRNA 水平）、RNA 病毒（如流感病毒、新冠病毒）檢測等。
衍生技術(shù)：實(shí)時熒光定量 RT-PCR，可定量分析 RNA 含量。
二、核酸雜交技術(shù)
利用核酸分子的堿基互補(bǔ)配對原則，通過標(biāo)記的探針與目標(biāo)核酸結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特異性檢測。
1、Southern 印跡雜交
原理：將經(jīng)電泳分離的 DNA 片段轉(zhuǎn)移至膜上，與標(biāo)記的 DNA 探針雜交，通過顯影檢測目標(biāo) DNA。
應(yīng)用：基因定位、DNA 片段鑒定、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析等。
2、Northern 印跡雜交
原理：與 Southern 印跡類似，但檢測對象為 RNA，用于分析特定 RNA 的大小和表達(dá)量。
應(yīng)用：mRNA 表達(dá)水平檢測、RNA 結(jié)構(gòu)分析等。
3、原位雜交（ISH）
原理：將標(biāo)記的探針直接與細(xì)胞或組織中的核酸（DNA 或 RNA）雜交，通過顯微鏡觀察雜交信號的位置和強(qiáng)度。
應(yīng)用：病原體在組織中的定位、基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位等。
衍生技術(shù)：熒光原位雜交（FISH），用熒光標(biāo)記探針，分辨率更高，可用于染色體異常檢測（如染色體易位）。
4、斑點(diǎn)雜交 / 狹縫雜交
原理：將核酸樣本直接點(diǎn)樣到膜上，與探針雜交，快速檢測樣本中是否存在目標(biāo)核酸。
應(yīng)用：批量樣本的初篩（如病原體感染快速篩查）。
三、基因測序技術(shù)
直接測定核酸的堿基序列，是分析基因結(jié)構(gòu)和變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
1、Sanger 測序（鏈終止法）
原理：在 DNA 合成反應(yīng)中加入雙脫氧核苷酸（ddNTP）終止鏈延伸，通過電泳分離不同長度的片段，讀取堿基序列。
應(yīng)用：單基因測序、基因突變檢測、質(zhì)粒測序等。
特點(diǎn)：準(zhǔn)確率高（>99.99%），但通量低，適用于小片段測序。
2、下一代測序（NGS，高通量測序）
原理：通過大規(guī)模并行測序技術(shù)，同時對百萬至數(shù)十億條 DNA 片段進(jìn)行測序，快速獲得海量序列數(shù)據(jù)。
應(yīng)用：全基因組測序（WGS）、宏基因組分析（如腸道菌群多樣性）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、外顯子測序等。
特點(diǎn)：高通量、低成本，可檢測未知基因或復(fù)雜變異，但數(shù)據(jù)分析復(fù)雜。
四、核酸指紋圖譜技術(shù)
通過分析基因組的多態(tài)性，生成特異性“指紋”，用于菌株分型、親緣關(guān)系分析等。
1、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）
原理：用限制性內(nèi)切酶切割基因組 DNA，通過電泳分離片段，結(jié)合雜交技術(shù)分析片段長度差異，反映基因多態(tài)性。
應(yīng)用：細(xì)菌分型、親子鑒定等，但操作較繁瑣，已逐漸被其他技術(shù)替代。
2、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）
原理：用隨機(jī)引物（通常 10 個堿基）擴(kuò)增基因組 DNA，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性區(qū)分不同樣本。
應(yīng)用：菌株快速分型、物種親緣關(guān)系分析，成本低但重復(fù)性較差。
3、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）
原理：結(jié)合限制性酶切和 PCR 擴(kuò)增，對酶切后的 DNA 片段加上接頭，再用特異性引物擴(kuò)增，通過片段多態(tài)性分析樣本差異。
應(yīng)用：高精度分型（如細(xì)菌、植物品種鑒定），但操作復(fù)雜。
4、多位點(diǎn)序列分型（MLST）
原理：對多個管家基因（如 7-10 個）的內(nèi)部片段進(jìn)行測序，通過序列變異確定等位基因編號，組合成序列型（ST 型），用于菌株分型。
應(yīng)用：細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析、流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果可標(biāo)準(zhǔn)化且易比較。
五、其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)
1、基因芯片（DNA 微陣列）：
將大量探針固定在芯片上，與熒光標(biāo)記的樣本核酸雜交，通過檢測熒光信號強(qiáng)度，同時分析數(shù)千至數(shù)萬個基因的表達(dá)或變異。應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、病原體高通量檢測等。
2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）：
在等溫條件下（60-65℃），通過特殊引物和 DNA 聚合酶快速擴(kuò)增目標(biāo) DNA，產(chǎn)物可通過濁度或熒光檢測。特點(diǎn)是快速、無需熱循環(huán)儀，適用于現(xiàn)場檢測（如基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)或野外）。
3、核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：
針對 RNA 的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無需逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 的溫度循環(huán)，適用于 RNA 病毒的快速檢測。
六、總結(jié)
基于分子生物學(xué)的檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量等優(yōu)勢，選擇時需根據(jù)檢測目標(biāo)（DNA/RNA、已知 / 未知序列）、樣本類型、通量需求及實(shí)驗(yàn)條件綜合考慮：
快速篩查或定量：優(yōu)先選擇 qPCR、LAMP；
基因序列分析或未知變異檢測：依賴 Sanger 測序或 NGS；
菌株分型或流行病學(xué)調(diào)查：常用 MLST、RAPD 等指紋圖譜技術(shù)；
原位定位：選擇 FISH 或原位雜交。
這些技術(shù)的不斷發(fā)展和融合，極大地推動了生命科學(xué)研究和臨床診斷的進(jìn)步。
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