真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)的核心原理與操作流程及優(yōu)化策略！
小楊 / 2025-08-25 09:59:34
百歐博偉生物：真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)是真菌遺傳操作（如原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化、基因編輯）、生理研究及次生代謝產(chǎn)物開發(fā)的核心技術(shù)之一，其核心是通過酶解去除真菌細胞壁，獲得具有活性的原生質(zhì)體（僅由細胞膜包裹細胞質(zhì)的裸細胞）。該技術(shù)的關(guān)鍵在于細胞壁高效酶解與原生質(zhì)體活性維持，需根據(jù)真菌種類（如
酵母菌、
絲狀真菌、
擔子菌）的細胞壁結(jié)構(gòu)差異優(yōu)化方案，具體流程可分為以下 5 個核心步驟，同時需注意關(guān)鍵影響因素的控制：
一、技術(shù)核心原理
真菌細胞壁主要由多糖 、少量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，不同類群成分差異顯著（如酵母菌以甘露聚糖 - 葡聚糖為主，絲狀真菌以幾丁質(zhì) - 葡聚糖為主）。原生質(zhì)體制備的本質(zhì)是利用專一性酶系（如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶）降解細胞壁多糖，同時通過滲透壓穩(wěn)定劑（如蔗糖、山梨醇）維持原生質(zhì)體形態(tài)（避免吸水破裂或失水皺縮），最終獲得完整、有活性的原生質(zhì)體。
二、詳細操作流程
1、菌株選擇與預處理（奠定酶解基礎(chǔ)）
菌株選擇：優(yōu)先選擇對數(shù)生長期的細胞 / 菌絲—— 此時細胞代謝活躍、細胞壁結(jié)構(gòu)疏松，酶解效率最高。
酵母菌：培養(yǎng)至 OD???=0.6-0.8 的對數(shù)期（約 12-16h，液體搖瓶培養(yǎng)）；
絲狀真菌：培養(yǎng) 3-5d 的菌絲體（固體平板或液體深層培養(yǎng)，選擇幼嫩菌絲，避免老化菌絲細胞壁增厚）。
預處理：針對部分細胞壁結(jié)構(gòu)緊密或含次生代謝產(chǎn)物（如色素、蠟質(zhì)）的菌株，需通過預處理削弱細胞壁，提高酶解效率：
化學預處理：用 0.01-0.1mol/L EDTA（乙二胺四乙酸） 螯合細胞壁中的 Ca²?、Mg²?（破壞細胞壁交聯(lián)結(jié)構(gòu)），或用 0.1%-1% β- 巰基乙醇 破壞細胞壁蛋白質(zhì)的二硫鍵；
物理預處理：對絲狀真菌可采用研磨破碎菌絲（避免過度研磨損傷細胞），或用超聲波（低功率，100-300W）輕微處理，破壞菌絲束結(jié)構(gòu)。
2、酶解體系構(gòu)建（關(guān)鍵步驟）
酶解是原生質(zhì)體制備的核心，需根據(jù)真菌細胞壁成分選擇復合酶系，并優(yōu)化酶解條件以平衡“酶解效率”與“原生質(zhì)體活性”。
真菌類型 推薦酶系（復合使用） 酶濃度（終濃度） 酶解條件（溫度 /pH） 酶解時間
酵母菌（如
釀酒酵母） 甘露聚糖酶 + 葡聚糖酶 + 纖維素酶 1-5mg/mL 28-30℃ / pH 5.5-6.0 1-3h
絲狀真菌（如
曲霉） 幾丁質(zhì)酶 + 葡聚糖酶 + 蝸牛酶（輔助降解蛋白質(zhì)） 2-8mg/mL 30-32℃ / pH 5.0-5.8 2-6h
擔子菌（如
香菇） 幾丁質(zhì)酶 + 纖維素酶 + 果膠酶 3-10mg/mL 25-28℃ / pH 4.8-5.5 4-8h
滲透壓穩(wěn)定劑選擇：需與真菌細胞內(nèi)滲透壓匹配，常用類型包括：
高滲糖類：0.6-1.2mol/L 蔗糖（絲狀真菌首選）、0.8-1.0mol/L 山梨醇（酵母菌首選）；
鹽類：0.5-0.8mol/L KCl 或 NaCl（適用于耐鹽真菌，成本較低，但需注意鹽濃度對酶活性的影響）。
酶解操作：將預處理后的細胞 / 菌絲按 10?-10?個 /mL 的密度懸浮于酶解液中，置于搖床（50-100r/min，溫和振蕩） 或恒溫水浴中酶解，期間需定時取樣觀察（顯微鏡下觀察原生質(zhì)體釋放情況），避免酶解過度導致原生質(zhì)體破裂。
3、原生質(zhì)體分離與純化（去除雜質(zhì)）
酶解后體系中含未酶解的菌絲碎片、殘留酶液及雜質(zhì)，需通過以下步驟純化：
過濾除渣：用 200-400 目尼龍網(wǎng)過濾酶解液，去除未酶解的菌絲塊（避免干擾后續(xù)離心）；
低速離心收集：將過濾液置于離心管中，以500-1000×g 離心 5-10min（轉(zhuǎn)速過高會導致原生質(zhì)體破裂），棄上清（含殘留酶和雜質(zhì)）；
洗滌純化：用預冷的滲透壓穩(wěn)定劑重懸沉淀，重復離心 2-3 次，最終獲得純凈的原生質(zhì)體沉淀。
4、原生質(zhì)體質(zhì)量檢測（確?；钚耘c完整性）
制備后需通過 3 項核心指標評估原生質(zhì)體質(zhì)量，以滿足后續(xù)實驗需求：
產(chǎn)量檢測：用血球計數(shù)板計數(shù)，計算公式：原生質(zhì)體產(chǎn)量（個 /mL）= 計數(shù)室平均細胞數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10?；優(yōu)質(zhì)制備量通常需達到 10?-10?個 /mL；
活性檢測：采用臺盼藍染色法（活原生質(zhì)體細胞膜完整，不吸收染料，呈無色；死細胞呈藍色），活性需≥80% 方可用于后續(xù)實驗；
完整性檢測：顯微鏡（400×）觀察，活的原生質(zhì)體呈球形、透亮、無明顯破損，若出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)或內(nèi)容物泄漏，說明制備失敗。
5、原生質(zhì)體保存（短期或長期使用）
短期保存：將純化后的原生質(zhì)體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中，置于4℃冰箱，可保存 1-2d（活性會逐漸下降，需盡快使用）；
長期保存：加入 10%-20% 甘油作為保護劑，置于-80℃冰箱或液氮（-196℃）中，可保存數(shù)月至數(shù)年（解凍時需快速水浴升溫至 37℃，避免反復凍融）。
三、關(guān)鍵影響因素與優(yōu)化策略
原生質(zhì)體制備成功率受多種因素影響，需針對具體菌株優(yōu)化：
菌株遺傳背景：不同菌株的細胞壁厚度、多糖組成差異大（如同一屬的不同曲霉，幾丁質(zhì)含量可能相差 20%），需通過預實驗篩選適合的酶系；
酶的純度與活性：優(yōu)先選擇商用高活性酶，避免使用失活酶（酶活性可通過 DNS 法檢測還原糖釋放量評估）；
滲透壓平衡：穩(wěn)定劑濃度過低會導致原生質(zhì)體吸水破裂，過高則導致失水皺縮，需通過梯度實驗（如 0.4、0.6、0.8mol/L 蔗糖）確定最佳濃度；
酶解時間：酶解不足會導致產(chǎn)量低，過度則會破壞原生質(zhì)體膜，需定時取樣觀察（通常在酶解 1h 后，每 30min 觀察一次）。
四、技術(shù)應(yīng)用場景
制備的活性原生質(zhì)體可用于多種下游研究：
遺傳育種：原生質(zhì)體融合（跨越種間屏障，培育高產(chǎn)菌株，如工業(yè)發(fā)酵用的青霉素高產(chǎn)曲霉）；
基因操作：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（將外源基因?qū)胝婢毎?，如酵母表達載體的轉(zhuǎn)化）；
生理研究：研究細胞膜功能、細胞壁合成機制，或用于原生質(zhì)體再生實驗（觀察細胞壁重建過程）；
次生代謝：部分真菌原生質(zhì)體可在體外誘導產(chǎn)生更高產(chǎn)量的次生代謝產(chǎn)物（如抗生素、真菌毒素）。
綜上，真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)的核心是“針對性酶解”與“滲透壓控制”，需根據(jù)真菌種類優(yōu)化流程，同時嚴格把控質(zhì)量檢測環(huán)節(jié)，才能獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
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