環(huán)境中微生物檢測(cè)和分離純化實(shí)驗(yàn)的核心原理與操作步驟！
小楊 / 2025-09-24 10:31:07
百歐博偉生物：環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化實(shí)驗(yàn)，核心是通過(guò)取樣、培養(yǎng)、分離、純化四個(gè)關(guān)鍵步驟，從土壤、水、空氣等環(huán)境樣本中捕捉微生物，并獲得單一菌種，為后續(xù)鑒定和研究奠定基礎(chǔ)。
一、實(shí)驗(yàn)核心原理
環(huán)境中存在大量肉眼不可見(jiàn)的微生物（細(xì)菌、真菌等），它們因種類不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、溫度、氧氣的需求存在差異。實(shí)驗(yàn)正是利用這一特性：
選擇性培養(yǎng)：使用特定培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌），讓目標(biāo)微生物快速繁殖，抑制其他雜菌。
單菌落分離：微生物在固體培養(yǎng)基上繁殖時(shí)，單個(gè)菌體或孢子會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的“單菌落”，每個(gè)單菌落理論上由一種微生物組成，這是純化的關(guān)鍵依據(jù)。
二、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
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三、詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟（以土壤樣本為例）
1、樣本稀釋（避免菌落重疊，便于計(jì)數(shù)和分離）
稱取 10g 土壤樣本，放入裝有 90mL 無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩 30 分鐘（使微生物充分分散），得到10?¹ 稀釋液。
用無(wú)菌移液器吸取 1mL 10?¹ 稀釋液，注入裝有 9mL 無(wú)菌水的離心管中，混勻后得到10?² 稀釋液。
重復(fù)上述操作，依次制備10?³、10??、10?? 稀釋液（根據(jù)土壤污染程度調(diào)整，一般選 10?³~10??三個(gè)梯度）。
2、涂布接種（將微生物均勻接種到培養(yǎng)基上）
取無(wú)菌培養(yǎng)皿，在皿底貼好標(biāo)簽，注明樣本類型、稀釋度、日期。
用無(wú)菌移液器吸取 0.1mL 某一稀釋度的菌液，滴在對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基中央。
點(diǎn)燃酒精燈，將涂布棒在火焰上灼燒滅菌（冷卻 30 秒，避免燙死微生物），然后在培養(yǎng)基表面輕輕涂布，使菌液均勻分布。
每個(gè)稀釋度做 3 個(gè)重復(fù)（減少誤差），同時(shí)設(shè)置“空白對(duì)照”（只加 0.1mL 無(wú)菌水，檢測(cè)培養(yǎng)基是否污染）。
3、恒溫培養(yǎng)（提供適宜環(huán)境，讓微生物繁殖）
細(xì)菌培養(yǎng)：將接種好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 18-24 小時(shí)（倒置可防止冷凝水滴落污染菌落）。
真菌培養(yǎng)：將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基放入 28℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 3-5 天（真菌生長(zhǎng)速度慢于細(xì)菌）。
4、菌落觀察與計(jì)數(shù)（初步檢測(cè)微生物數(shù)量）
培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上的菌落形態(tài)：
細(xì)菌菌落：通常較小，表面光滑或粗糙，顏色多為白色、黃色。
真菌菌落：較大，呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，顏色多樣（如綠色、黑色、紅色）。
選擇菌落數(shù)在 30-300 之間的平板（計(jì)數(shù)最準(zhǔn)確），統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落數(shù)，按公式計(jì)算每克土壤中的微生物數(shù)量：
微生物數(shù)量（CFU/g）= 平板平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) / 接種菌液體積（0.1mL）
5、分離純化（獲得單一菌種）
用接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌，冷卻后挑取平板上形態(tài)不同的單菌落（挑取時(shí)盡量只取菌落邊緣，避免雜菌污染）。
將挑取的菌落劃線接種到新的固體培養(yǎng)基上（劃線方法：先劃一條直線，轉(zhuǎn)動(dòng)平板 45°，從第一條線末端開(kāi)始劃第二條線，重復(fù) 3-4 次，使菌體逐漸稀釋）。
再次放入對(duì)應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后，重復(fù)劃線 1-2 次，直至平板上所有菌落形態(tài)完全一致，即獲得純化的菌種。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避免實(shí)驗(yàn)失敗的核心）
無(wú)菌操作貫穿全程：所有工具（接種環(huán)、涂布棒、移液器）需滅菌，操作時(shí)靠近酒精燈火焰（利用火焰形成的無(wú)菌區(qū)），避免手或空氣直接接觸培養(yǎng)基和菌液。
稀釋梯度選擇合理：若稀釋度過(guò)高，平板上菌落太少（<30），計(jì)數(shù)誤差大；稀釋度過(guò)低，菌落重疊（>300），無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
劃線純化技巧：每次劃線前接種環(huán)需重新滅菌，且后一次劃線要與前一次劃線末端交叉，確保菌體逐步稀釋，最終形成單菌落。
培養(yǎng)溫度和時(shí)間準(zhǔn)確：細(xì)菌和真菌的最適溫度不同，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短菌落未長(zhǎng)出，過(guò)長(zhǎng)則菌落過(guò)度繁殖導(dǎo)致重疊。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
結(jié)果記錄：繪制“菌落形態(tài)記錄表”，記錄不同樣本（如土壤、水、空氣）的菌落數(shù)量、顏色、形狀、大小。
常見(jiàn)問(wèn)題分析：
平板無(wú)菌落：可能是稀釋過(guò)度、接種時(shí)菌液流失、培養(yǎng)基滅菌不徹底（對(duì)照平板也無(wú)菌落可排除此問(wèn)題）。
菌落形態(tài)混雜：純化不徹底，需重新挑取單菌落劃線。
對(duì)照平板有菌落：培養(yǎng)基或無(wú)菌水被污染，實(shí)驗(yàn)需重做。
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