微生物計(jì)數(shù)檢查方法驗(yàn)證中，如何確定方法的檢測(cè)限？
小楊 / 2025-09-25 10:05:56
百歐博偉生物：微生物計(jì)數(shù)檢查方法驗(yàn)證中，檢測(cè)限（LOD）的確定核心是找到方法能穩(wěn)定檢出目標(biāo)微生物的最低濃度，需通過“梯度稀釋 + 平行試驗(yàn) + 概率判斷”的邏輯，排除藥品基質(zhì)干擾，確保結(jié)果可靠。
檢測(cè)限的確定需圍繞“藥品基質(zhì)是否有抑菌性”分基礎(chǔ)流程和特殊處理，同時(shí)嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照，避免假陰性或假陽性結(jié)果。
一、確定檢測(cè)限的核心原則
目標(biāo)聚焦“最低可檢出濃度”：不同于化學(xué)檢測(cè)的“定量限”，微生物檢測(cè)限更關(guān)注“是否能檢出”（定性屬性），而非“準(zhǔn)確計(jì)數(shù)”，需通過多次試驗(yàn)驗(yàn)證穩(wěn)定性。
必須結(jié)合藥品基質(zhì)：檢測(cè)限需在“供試品溶液 + 微生物”的體系中確定，不能僅用空白稀釋液測(cè)試，避免忽略藥品抑菌性導(dǎo)致的“假高檢測(cè)限”。
依賴概率判斷：因微生物分布存在隨機(jī)性（如 1~10 CFU/mL 的溶液中，某 1mL 可能不含微生物），需通過多份平行樣品的檢出率判斷，而非單次結(jié)果。
二、基礎(chǔ)操作流程（適用于無抑菌性或弱抑菌性藥品）
按《中國藥典》及 ICH Q2 (R1) 指導(dǎo)原則，標(biāo)準(zhǔn)流程分 4 步，需同步設(shè)置 3 類對(duì)照，確保結(jié)果有效。
1、準(zhǔn)備工作：確定關(guān)鍵材料與參數(shù)
對(duì)照菌株選擇：需覆蓋藥品可能污染的微生物類型，至少包含 2 種代表性菌株（如細(xì)菌選
金黃色葡萄球菌，酵母菌選
白色念珠菌，霉菌選
黑曲霉），菌株需為藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株（如 ATCC 菌株）。
供試品溶液制備：按待驗(yàn)證的微生物計(jì)數(shù)方法，制備供試品溶液（如固體藥品需研磨后溶解、稀釋，液體藥品直接稀釋），確保與實(shí)際檢測(cè)時(shí)的樣品處理方式完全一致。
稀釋液選擇：使用無菌稀釋液（如胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、0.9% 無菌氯化鈉溶液），需與供試品溶液兼容，無額外抑菌或促生長作用。
2、核心步驟：梯度稀釋與平行試驗(yàn)
菌株梯度稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)菌株用無菌稀釋液稀釋至1~10 CFU/mL 的低濃度區(qū)間（預(yù)試驗(yàn)確定大致范圍），確保每 1mL 稀釋液中微生物數(shù)量接近“可能檢出的臨界值”。示例：若預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 10 CFU/mL 時(shí) 100% 檢出，5 CFU/mL 時(shí)部分檢出，則重點(diǎn)測(cè)試 5 CFU/mL 和 1 CFU/mL 兩個(gè)梯度。
樣品制備與培養(yǎng)：
取上述低濃度菌液，按“供試品溶液：菌液 = 9:1”的比例混合（或按待驗(yàn)證方法的加樣體積比例），制備至少 5 份平行樣品（越多越能體現(xiàn)隨機(jī)性，通常 5~10 份）。
同步設(shè)置 3 類對(duì)照，排除干擾：
陽性對(duì)照：空白稀釋液 + 低濃度菌液（無藥品基質(zhì)），驗(yàn)證菌株活性和培養(yǎng)條件是否合格。
供試品空白對(duì)照：供試品溶液 + 無菌稀釋液（無微生物），驗(yàn)證藥品本身是否有雜菌污染。
培養(yǎng)基空白對(duì)照：僅培養(yǎng)基，驗(yàn)證培養(yǎng)基無菌性。
培養(yǎng)與觀察：按待驗(yàn)證方法的條件培養(yǎng)（如細(xì)菌用 TSA 培養(yǎng)基 30~35℃培養(yǎng) 18~24h，霉菌用 SDA 培養(yǎng)基 20~25℃培養(yǎng) 5~7d），觀察每一份樣品是否出現(xiàn)目標(biāo)菌落（需與陽性對(duì)照的菌落形態(tài)一致，排除雜菌）。
3、結(jié)果判斷：基于檢出率確定檢測(cè)限
核心標(biāo)準(zhǔn)：若某一濃度下，≥90% 的平行樣品能檢出目標(biāo)微生物（即出現(xiàn)符合形態(tài)的菌落），且陽性對(duì)照 100% 檢出、空白對(duì)照均無菌落，則該濃度即為方法的檢測(cè)限。
示例：測(cè)試 5 CFU/mL 時(shí)，5 份樣品中有 5 份檢出（100%）；測(cè)試 1 CFU/mL 時(shí)，5 份樣品中有 3 份檢出（60%），則檢測(cè)限為 5 CFU/mL。
特殊情況：若所有測(cè)試濃度的檢出率均低于 90%，需返回“消除藥品抑菌性”步驟，重新優(yōu)化方法后再測(cè)試。
二、特殊情況處理：含抑菌性藥品的檢測(cè)限確定
抗生素、消毒劑、含生物堿的中藥等具有強(qiáng)抑菌性，直接按上述流程測(cè)試會(huì)導(dǎo)致微生物無法生長（檢出率 0%），需先消除抑菌性，再確定檢測(cè)限，常用方法如下：
稀釋法：將供試品溶液用無菌稀釋液（如胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）稀釋至“抑菌性消失的濃度”（通過預(yù)試驗(yàn)確定：如稀釋 100 倍后，加入 100 CFU/mL 的菌株，回收率能達(dá)到 50% 以上），再按基礎(chǔ)流程測(cè)試檢測(cè)限。
中和法：在供試品溶液中加入能特異性中和抑菌成分的試劑，如用 β- 內(nèi)酰胺酶中和青霉素類抗生素，用硫代硫酸鈉中和含氯消毒劑（需驗(yàn)證中和劑無毒性，且不影響微生物生長），再進(jìn)行梯度稀釋和檢出試驗(yàn)。
過濾法：用無菌濾膜（孔徑 0.45μm）過濾供試品溶液，微生物會(huì)截留于濾膜上；用無菌稀釋液沖洗濾膜 3~5 次（去除殘留抑菌成分），再將濾膜轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，后續(xù)按基礎(chǔ)流程判斷檢測(cè)限。
三、注意事項(xiàng)：避免檢測(cè)限確定結(jié)果失真
稀釋操作需嚴(yán)格無菌：所有稀釋液、移液管、容器需滅菌，操作在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，防止外界微生物污染導(dǎo)致“假陽性”，誤判檢測(cè)限。
菌株活性需驗(yàn)證：使用前需將標(biāo)準(zhǔn)菌株活化（如在 TSA 培養(yǎng)基上傳代 1~2 次），確保菌株處于對(duì)數(shù)生長期，避免因菌株活性低導(dǎo)致“假陰性”，低估檢測(cè)限。
平行樣品數(shù)量足夠：至少制備 5 份平行樣品，若樣品量允許，可增加至 10 份，減少微生物隨機(jī)分布對(duì)結(jié)果的影響（如 1 CFU/mL 的溶液中，某 1mL 可能恰好不含微生物，多份樣品可降低這種偶然性）。
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