微生物菌種冷凍干燥保藏技術(shù)的預(yù)凍環(huán)節(jié)需要注意什么？
小楊 / 2025-10-10 10:00:08
百歐博偉生物：微生物菌種冷凍干燥保藏的預(yù)凍環(huán)節(jié)，核心是避免大冰晶形成對細(xì)胞的物理損傷，同時(shí)確保菌懸液完全凍結(jié)，為后續(xù)真空干燥打下基礎(chǔ)，需重點(diǎn)注意以下 5 個(gè)方面：
一、預(yù)凍前：菌懸液與凍干管的準(zhǔn)備細(xì)節(jié)
這是預(yù)凍的基礎(chǔ)，直接影響后續(xù)凍結(jié)效果和菌種活性。
1、菌懸液濃度與保護(hù)劑適配
菌濃度需控制在 10?~10? CFU/mL（細(xì)菌 / 酵母） 或 10?~10? 個(gè) /mL（真菌孢子），濃度過低會導(dǎo)致凍干后活菌數(shù)量不足，濃度過高則可能因細(xì)胞密集導(dǎo)致凍結(jié)不均。
必須使用預(yù)冷至 4℃的保護(hù)劑（如 10% 脫脂乳、5% 甘油）重懸菌種，避免室溫保護(hù)劑與低溫預(yù)凍環(huán)境形成溫差，刺激細(xì)胞；且保護(hù)劑需與菌種匹配（如乳酸菌忌用甘油，需用脫脂乳），否則會加重凍干損傷。
2、凍干管裝量與密封性
每支凍干管的菌懸液裝量需嚴(yán)格控制在 0.2~0.5mL，液面高度不超過 1cm，若裝量過多或液面過高，會導(dǎo)致凍結(jié)速度慢、形成大冰晶，且后續(xù)干燥時(shí)間延長，增加菌種失活風(fēng)險(xiǎn)。
塞橡膠塞時(shí)需留 1~2mm 縫隙（不塞緊），既避免預(yù)凍時(shí)管內(nèi)空氣膨脹導(dǎo)致管子破裂，也為后續(xù)真空干燥預(yù)留通道；同時(shí)需確保橡膠塞已滅菌且干燥，防止污染。
二、預(yù)凍中：降溫速率與凍結(jié)溫度的控制（核心關(guān)鍵）
降溫速率是預(yù)凍環(huán)節(jié)最核心的參數(shù)，直接決定冰晶形態(tài) —— 快速降溫形成“玻璃態(tài)小冰晶”，緩慢降溫形成“大冰晶”，后者會刺穿細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。
1、優(yōu)先選擇程序降溫預(yù)凍（推薦）
適用場景：所有菌種，尤其對脆弱菌種（如乳酸菌、無芽孢細(xì)菌）必須使用。
操作要點(diǎn)：將凍干管放入程序降溫儀，設(shè)置降溫速率為 1℃~2℃/ 分鐘，從室溫逐步降至 -40℃~-50℃，并在該溫度下保溫 1~2 小時(shí)。
原理：緩慢勻速降溫讓水分有序凍結(jié)，避免局部溫度驟變形成大冰晶；保溫階段確保管內(nèi)所有水分（包括細(xì)胞內(nèi)結(jié)合水）完全凍結(jié)，無液態(tài)殘留。
2、簡易直接預(yù)凍（僅適用于抗逆性強(qiáng)的菌種）
適用場景：芽孢桿菌、放線菌孢子等抗逆性強(qiáng)的微生物，不適合脆弱菌種。
操作要點(diǎn)：將凍干管直接放入裝有干冰（-78.5℃）的保溫盒（需用脫脂棉填充固定，避免管子碰撞），或放入冷凍干燥機(jī)預(yù)冷至 - 40℃的樣品架，保溫 2~3 小時(shí)。
注意：直接接觸干冰時(shí)，需用鑷子操作，避免凍傷；且需定期檢查干冰量，防止干冰揮發(fā)導(dǎo)致溫度回升。
3、嚴(yán)禁“快速驟冷”
絕對不能將室溫菌懸液直接投入液氮（-196℃）或超低溫冰箱（-80℃），驟冷會導(dǎo)致水分瞬間凍結(jié)，形成尖銳的大冰晶，直接刺穿細(xì)胞膜，使菌種存活率降至 10% 以下。
三、預(yù)凍后：轉(zhuǎn)移與檢查的注意事項(xiàng)
預(yù)凍完成后，菌種處于脆弱狀態(tài)，轉(zhuǎn)移和檢查需快速且輕柔，避免溫度波動(dòng)。
1、快速轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)
預(yù)凍后的凍干管需在 5 分鐘內(nèi) 轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)的樣品架（此時(shí)凍干機(jī)需提前預(yù)冷至 - 40℃以下，且真空系統(tǒng)已準(zhǔn)備就緒），避免在室溫下暴露時(shí)間過長，導(dǎo)致表面冰層融化再凍結(jié)，形成二次大冰晶。
2、檢查凍結(jié)效果
轉(zhuǎn)移前需觀察凍干管內(nèi)菌懸液狀態(tài)：正常凍結(jié)應(yīng)為 均勻白色固體，無透明液態(tài)區(qū)域、無氣泡或分層；若出現(xiàn)液態(tài)殘留，需重新放入預(yù)凍環(huán)境，延長保溫時(shí)間至完全凍結(jié)。
四、特殊菌種的預(yù)凍差異化處理
不同類型微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗凍性不同，需針對性調(diào)整預(yù)凍參數(shù)，避免“一刀切”。
菌種類型 推薦預(yù)凍方式 預(yù)凍溫度（℃） 保溫時(shí)間（小時(shí)） 核心注意事項(xiàng)
細(xì)菌（無芽孢） 程序降溫預(yù)凍 -40~-50 1.5~2 必須用脫脂乳等保護(hù)劑，避免驟冷
細(xì)菌（芽孢） 程序降溫 / 直接預(yù)凍 -40~-50 1~1.5 可適當(dāng)縮短保溫時(shí)間，芽孢抗凍性強(qiáng)
酵母菌 程序降溫預(yù)凍 -45~-50 1.5~2 保護(hù)劑優(yōu)先選 10% 蔗糖，減少細(xì)胞脫水
真菌孢子 程序降溫 / 直接預(yù)凍 -40~-45 2~2.5 確保孢子完全成熟，避免菌絲殘留
病毒 程序降溫預(yù)凍 -50~-60 2~3 需用含血清的保護(hù)劑，防止病毒衣殼破裂
五、設(shè)備與安全操作規(guī)范
預(yù)凍涉及低溫設(shè)備（干冰、程序降溫儀），需遵守安全規(guī)范，避免設(shè)備故障和人員傷害。
1、設(shè)備檢查
程序降溫儀使用前需校準(zhǔn)溫度傳感器，確保顯示溫度與實(shí)際溫度誤差不超過 ±1℃；干冰保溫盒需檢查密封性，避免干冰過快揮發(fā)。
2、人員防護(hù)
操作干冰或低溫設(shè)備時(shí)，必須佩戴防低溫手套和護(hù)目鏡，避免皮膚直接接觸 - 40℃以下的物體，防止凍傷；若干冰揮發(fā)的 CO?濃度過高，需及時(shí)通風(fēng)，避免窒息。
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