分子生物學技術在微生物檢驗中的主要應用與未來發(fā)展趨勢！
小楊 / 2025-10-16 10:03:01
百歐博偉生物：分子生物學技術以其高靈敏度、高特異性、快速和自動化的優(yōu)勢，徹底改變了傳統(tǒng)微生物檢驗的面貌，已成為現(xiàn)代臨床診斷、公共衛(wèi)生和基礎研究的核心工具。
一、與傳統(tǒng)方法的比較：為何需要分子生物學技術？
1、傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定）：
優(yōu)點：金標準，可提供活菌用于藥敏試驗，成本較低。
缺點：耗時長（數(shù)天至數(shù)周）、靈敏度低（需一定菌量）、對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物無能為力（如病毒、衣原體、部分真菌）。
2、分子生物學方法：
優(yōu)點：快速（數(shù)小時）、靈敏度極高（可檢測單個拷貝的基因）、特異性強（精準識別）、不依賴微生物的培養(yǎng)能力。
缺點：成本較高、無法區(qū)分死菌與活菌（除非使用mRNA靶標）、對實驗室條件和人員素質要求高、通常無法直接提供藥敏結果（宏基因組學除外）。
二、核心分子生物學技術及其應用
1、核酸擴增技術
這是應用最廣泛、最成熟的一類技術，核心是聚合酶鏈式反應（PCR）。
常規(guī)PCR：
原理：通過引物特異性擴增目標微生物的特定基因片段。
實時熒光定量PCR（qPCR）：
原理：在PCR反應體系中加入熒光探針或染料，實時監(jiān)測擴增過程，通過Ct值對模板進行定量分析。
應用：
病原體定量：監(jiān)測HIV、HBV、HCV的病毒載量，用于療效評估。
快速診斷：在數(shù)小時內檢測呼吸道病原體、胃腸道病原體、中樞神經系統(tǒng)病原體等。
耐藥基因檢測：直接檢測臨床樣本中的耐藥基因，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的 mecA 基因、結核分枝桿菌的利福平耐藥 rpoB 基因突變。
逆轉錄PCR（RT-PCR）：
原理：先將RNA逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。
應用：專門用于檢測RNA病毒，如新型冠狀病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、流感病毒等。
等溫擴增技術：
原理：在恒定溫度下進行核酸擴增，無需昂貴的PCR儀。
代表技術：環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）。
應用：特別適合現(xiàn)場快速檢測（POCT）、基層醫(yī)院和資源匱乏地區(qū)。
2、核酸雜交技術
原理：用帶有標記的已知序列核酸單鏈（探針）與待測樣本中的互補核酸序列退火形成雙鏈。
應用：
熒光原位雜交（FISH）：直接在組織切片或涂片上定位和鑒定微生物，尤其適用于診斷難培養(yǎng)的細菌。
基因芯片/DNA微陣列：將大量探針固定于芯片上，一次反應可同時檢測數(shù)十至數(shù)百種病原體，常用于呼吸道、胃腸道病原體panel的篩查。
3、基因測序技術
這是最強大的技術，能提供最完整的遺傳信息。
Sanger測序（第一代）：
應用：
菌種鑒定：對16S rRNA基因進行測序，是鑒定罕見、疑難細菌的“金標準”。
耐藥突變分析：精確分析結核分枝桿菌、HIV等病原體的耐藥相關基因突變位點。
下一代測序（NGS）/高通量測序：
應用：
宏基因組學測序（mNGS）：革命性技術。無需培養(yǎng)，直接對臨床樣本中全部微生物（細菌、病毒、真菌、寄生蟲）的核酸進行測序。對于病因不明的重癥感染、新發(fā)突發(fā)傳染病的診斷具有無可替代的價值。
病原體分型與溯源：通過對全基因組進行測序，可進行高分辨力的分子分型，用于醫(yī)院感染暴發(fā)、食源性疾病暴發(fā)的溯源調查。
耐藥基因組學：通過分析全基因組序列，預測其完整的耐藥譜。
4、蛋白質和質譜技術
雖然屬于蛋白層面，但其發(fā)展依賴于基因組數(shù)據庫，常與分子技術聯(lián)用。
MALDI-TOF質譜：
原理：獲得微生物自身蛋白質的“指紋圖譜”，與數(shù)據庫比對進行快速鑒定。
應用：已取代大部分生化鑒定，成為臨床微生物實驗室細菌、酵母樣真菌鑒定的主流技術，可在數(shù)分鐘內完成。
三、主要應用領域總結
病原體快速檢測與鑒定：取代或補充傳統(tǒng)培養(yǎng)，尤其適用于難培養(yǎng)、生長緩慢或危險的病原體。
流行病學與感染控制：通過分子分型追蹤傳染源和傳播途徑，控制醫(yī)院內感染暴發(fā)。
耐藥性檢測：直接檢測耐藥基因或通過測序預測耐藥表型，指導臨床精準用藥。
病毒載量監(jiān)測：定量監(jiān)測抗病毒治療的效果。
新發(fā)傳染病病原體的發(fā)現(xiàn)與鑒定：mNGS等技術在發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒、SARS病毒等過程中發(fā)揮了關鍵作用。
四、未來發(fā)展趨勢
即時檢測（POCT）：開發(fā)更小型、快速、自動化的分子診斷設備，使檢測在床旁、社區(qū)甚至家庭中完成。
多重PCR與微流控技術結合：在一個芯片上實現(xiàn)從樣本處理到多重檢測的全自動化，一次檢測一個樣本中的數(shù)十種病原體。
生物信息學與人工智能：隨著NGS的普及，如何高效、準確地分析和解讀海量測序數(shù)據成為關鍵，AI將發(fā)揮越來越重要的作用。
宿主反應診斷：不僅檢測病原體，還通過分析宿主的基因表達譜來區(qū)分感染與非感染、判斷感染嚴重程度和預后。
總之，分子生物學技術已經成為微生物檢驗領域不可或缺的支柱，它極大地提升了我們診斷和應對感染性疾病的能力，并正朝著更快速、更全面、更精準和更智能的方向飛速發(fā)展。
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