細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法詳解之傳統(tǒng)培養(yǎng)法和快速檢測(cè)法！
小楊 / 2025-11-01 10:06:30
百歐博偉生物：細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)方法主要可以分為兩大類(lèi)：傳統(tǒng)培養(yǎng)法和快速檢測(cè)法。它們各有特點(diǎn)和適用場(chǎng)景。
一、傳統(tǒng)培養(yǎng)法（標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法）
這是最經(jīng)典、最基礎(chǔ)、也是目前國(guó)內(nèi)外通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。其核心原理是：讓活的細(xì)菌在適宜的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成肉眼可見(jiàn)的菌落，然后通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)推算樣品中的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果通常以菌落形成單位每毫升（或每克），即CFU/mL或CFU/g來(lái)表示。
1、基本流程：
（1）樣品處理與稀釋?zhuān)?/strong>
將固體或半固體樣品用無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液進(jìn)行均質(zhì)稀釋。
對(duì)于液體樣品，可以直接進(jìn)行稀釋或直接接種。
由于樣品中細(xì)菌數(shù)量可能很多，需要進(jìn)行一系列10倍遞增的稀釋?zhuān)ㄈ?0?¹, 10?², 10?³ ...），以獲得便于計(jì)數(shù)的菌落數(shù)（通常要求30-300個(gè)/平板）。
（2）接種與培養(yǎng)：
選擇2~3個(gè)適宜的稀釋度，分別吸取1mL稀釋液到無(wú)菌平皿中。
倒入冷卻至45-50℃的瓊脂培養(yǎng)基（最常用的是平板計(jì)數(shù)瓊脂，PCA），迅速輕輕搖勻，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，靜置凝固。
將平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，在36±1℃下培養(yǎng)48±2小時(shí)。
（3）計(jì)數(shù)與報(bào)告：
培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)。
選擇菌落數(shù)在30-300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得出樣品中的細(xì)菌總數(shù)。
2、優(yōu)點(diǎn)：
結(jié)果可靠：是國(guó)際公認(rèn)的基準(zhǔn)方法。
直觀：可以直接觀察菌落形態(tài)。
成本較低：設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單。
3、缺點(diǎn)：
耗時(shí)長(zhǎng)：通常需要2-3天才能出結(jié)果。
只能計(jì)數(shù)可培養(yǎng)的細(xì)菌：環(huán)境中很多細(xì)菌在人工培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果低估。
工作量大：步驟繁瑣，需要大量人工操作。
二、快速檢測(cè)法
為了滿足現(xiàn)代工業(yè)和商業(yè)對(duì)效率的需求，發(fā)展出了多種快速檢測(cè)技術(shù)。
1、微生物測(cè)試片/紙片法
這是一種簡(jiǎn)化版的培養(yǎng)法，使用預(yù)先制備好的、含有培養(yǎng)基和指示劑的測(cè)試片。
原理：將樣品液直接滴加到測(cè)試片上，在適宜溫度下培養(yǎng)，菌落會(huì)在測(cè)試片上顯色或產(chǎn)生易于計(jì)數(shù)的特征。
常見(jiàn)類(lèi)型：如菌落總數(shù)測(cè)試片、廣東環(huán)凱公司的細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片等。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、便于攜帶、減少交叉污染。
缺點(diǎn)：成本高于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，結(jié)果仍需培養(yǎng)時(shí)間。
2、儀器自動(dòng)化計(jì)數(shù)法
原理：利用高分辨率的圖像掃描儀和專(zhuān)業(yè)的圖像分析軟件，自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落。有些高級(jí)系統(tǒng)還能初步區(qū)分菌落類(lèi)型。
優(yōu)點(diǎn)：大大節(jié)省人力，減少人為計(jì)數(shù)誤差，提高計(jì)數(shù)效率和客觀性。
缺點(diǎn)：設(shè)備投資高，仍需培養(yǎng)步驟。
3、基于代謝活性的方法
這類(lèi)方法不直接計(jì)數(shù)菌落，而是通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌群體的代謝活性來(lái)間接估算微生物數(shù)量。
ATP生物發(fā)光法：
原理：所有活細(xì)胞都含有三磷酸腺苷（ATP）。當(dāng)ATP與熒光素酶反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生生物熒光。樣品中活的微生物越多，ATP含量就越高，發(fā)出的熒光就越強(qiáng)，通過(guò)光度計(jì)檢測(cè)熒光值即可推算出微生物總量。
優(yōu)點(diǎn)：極其快速，通常在幾分鐘內(nèi)即可得到結(jié)果。
缺點(diǎn)：無(wú)法區(qū)分細(xì)菌種類(lèi)，只能測(cè)總活性；對(duì)樣品潔凈度要求高，因?yàn)槿魏位罴?xì)胞（包括動(dòng)植物細(xì)胞）的ATP都會(huì)被檢測(cè)到。
阻抗/電導(dǎo)法：
原理：細(xì)菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，會(huì)將培養(yǎng)基中的大分子電惰性物質(zhì)（如糖類(lèi)、蛋白質(zhì)）分解成小分子電活性物質(zhì)（如乳酸、醋酸），從而改變培養(yǎng)基的導(dǎo)電性（阻抗）。通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基阻抗的變化，可以推算出微生物的初始數(shù)量，變化越快，說(shuō)明起始菌量越多。
優(yōu)點(diǎn)：可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，比傳統(tǒng)法快（通常在6-24小時(shí)內(nèi)出結(jié)果），自動(dòng)化程度高。
缺點(diǎn)：需要專(zhuān)用儀器，培養(yǎng)基特殊，且不同菌群代謝產(chǎn)物不同可能影響結(jié)果。
4、流式細(xì)胞術(shù)
原理：將樣品中的細(xì)菌用熒光染料染色（通常染色DNA，用于指示總菌數(shù)；或使用特殊染料區(qū)分活/死菌），然后使細(xì)菌單個(gè)地通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)通道，用激光激發(fā)熒光并計(jì)數(shù)。
優(yōu)點(diǎn)：速度極快（幾分鐘），結(jié)果精確，可以區(qū)分活菌和死菌。
缺點(diǎn)：儀器非常昂貴，操作和維護(hù)復(fù)雜，通常用于研究或高端檢測(cè)領(lǐng)域。
5、分子生物學(xué)方法
原理：通過(guò)提取樣品中所有細(xì)菌的DNA，利用針對(duì)細(xì)菌通用基因設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)定量樣品中的細(xì)菌總DNA量，從而推算細(xì)菌總數(shù)。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以檢測(cè)不可培養(yǎng)的細(xì)菌。
缺點(diǎn)：無(wú)法區(qū)分活菌和死菌（因?yàn)樗谰腄NA仍在），操作復(fù)雜，成本高，且結(jié)果受DNA提取效率和引物選擇的影響。
總結(jié)與選擇
方法類(lèi)別 原理 檢測(cè)時(shí)間 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 主要應(yīng)用
傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法 菌落培養(yǎng) 2-3天 金標(biāo)準(zhǔn)，成本低，直觀 耗時(shí)長(zhǎng)，只能測(cè)可培養(yǎng)菌 各類(lèi)食品、藥品、環(huán)境樣品的法定檢測(cè)
測(cè)試片法 菌落培養(yǎng)（簡(jiǎn)化） 1-2天 操作簡(jiǎn)便，便攜 成本稍高，仍需培養(yǎng) 現(xiàn)場(chǎng)快速篩查、生產(chǎn)線監(jiān)控
ATP生物發(fā)光法 檢測(cè)ATP 數(shù)分鐘 速度極快 不能區(qū)分菌種，干擾多 表面清潔度驗(yàn)證、衛(wèi)生監(jiān)控
阻抗法 檢測(cè)代謝物 6-24小時(shí) 自動(dòng)化，比傳統(tǒng)法快 需專(zhuān)用儀器和培養(yǎng)基 食品、飲料行業(yè)的快速質(zhì)控
流式細(xì)胞術(shù) 熒光染色計(jì)數(shù) 數(shù)分鐘 極快，可區(qū)分活/死菌 儀器昂貴，操作復(fù)雜 水處理、乳制品、研究機(jī)構(gòu)
qPCR法 檢測(cè)DNA 2-4小時(shí) 靈敏度高，可測(cè)不可培養(yǎng)菌 無(wú)法區(qū)分活/死菌，成本高 科研、特定病原體或菌群檢測(cè)
如何選擇？
作為法定檢驗(yàn)或科研基準(zhǔn)：必須使用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法。
用于生產(chǎn)過(guò)程中的快速監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：測(cè)試片法、ATP法和阻抗法是很好的選擇。
對(duì)速度和精度有極高要求，且預(yù)算充足：可以考慮流式細(xì)胞術(shù)。
需要了解樣品中總細(xì)菌（包括不可培養(yǎng)菌）的基因信息：會(huì)使用qPCR等方法。
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