食品微生物檢測中稀釋平板計數(shù)法的具體操作步驟與流程！
小楊 / 2025-11-14 10:36:24
百歐博偉生物：食品微生物檢測中，稀釋平板計數(shù)法主要用于定量分析食品中細(xì)菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)、致病菌（如
大腸桿菌、
沙門氏菌）活菌數(shù)，核心是通過樣品均質(zhì)化、梯度稀釋、傾注平板等步驟，實現(xiàn)單菌落分離與計數(shù)，確保結(jié)果符合食品衛(wèi)生國標(biāo)。以下是結(jié)合食品樣品特性的詳細(xì)可執(zhí)行操作流程，含樣品預(yù)處理、稀釋、接種、培養(yǎng)、計數(shù)全環(huán)節(jié)，兼顧安全性與準(zhǔn)確性：
一、實驗前準(zhǔn)備（符合食品檢測無菌要求）
1、器材與試劑準(zhǔn)備
（1）無菌器材
核心器材：無菌均質(zhì)袋（或均質(zhì)杯）、15mL 無菌試管、9cm 無菌培養(yǎng)皿、1mL/10mL 無菌移液管、移液器（10~1000μL）、無菌剪刀/鑷子、酒精燈、試管架、培養(yǎng)皿架。
輔助器材：高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱（37℃/28℃）、漩渦振蕩器、均質(zhì)器（拍打式/旋轉(zhuǎn)式）、電子天平（精度 0.1g）、冰箱（4℃）。
（2）試劑與培養(yǎng)基
稀釋液：0.85% 無菌生理鹽水（維持細(xì)菌滲透壓，避免細(xì)胞破裂），需高壓滅菌（121℃，15min），冷卻后 4℃?zhèn)溆茫ㄓ行?7 天）。
培養(yǎng)基（按檢測目標(biāo)選擇，均需滅菌）：
細(xì)菌總數(shù)計數(shù)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA，37℃培養(yǎng)）；
霉菌酵母菌總數(shù)：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂 PDA，28℃培養(yǎng)）；
大腸桿菌計數(shù)：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（鑒別性，37℃培養(yǎng)）；
沙門氏菌計數(shù)：SS 瓊脂培養(yǎng)基（選擇性，37℃培養(yǎng)）。
其他：75% 酒精、無菌棉片、樣品標(biāo)簽。
（3）環(huán)境與人員準(zhǔn)備
超凈工作臺：紫外線消毒 30min，開啟通風(fēng)扇 5~10min（排除臭氧），臺面用 75% 酒精擦拭消毒。
人員：穿戴無菌工作服、手套、口罩、帽子，雙手用 75% 酒精消毒，避免頭發(fā)、衣物接觸樣品和器材。
二、樣品預(yù)處理（食品樣品均質(zhì)化，關(guān)鍵第一步）
食品樣品（固體/半固體/液體）需先制成均勻懸液，避免局部濃度不均導(dǎo)致計數(shù)誤差，按樣品類型操作：
1、固體食品（如肉類、糕點、蔬菜、堅果）
樣品取樣：按國標(biāo)要求隨機取樣（如肉類取 25g，糕點取 25g），用無菌剪刀剪碎（避免交叉污染，剪刀需灼燒冷卻），放入無菌均質(zhì)袋中。
加入稀釋液：在均質(zhì)袋中加入 225mL 無菌生理鹽水（形成 1:10 的初始稀釋液，即 10?¹），密封均質(zhì)袋。
均質(zhì)處理：將均質(zhì)袋放入拍打式均質(zhì)器中，拍打 1~2min（速度 100~150 次 /min），使樣品與稀釋液充分混合，制成均勻懸液（若無雙均質(zhì)器，可用無菌玻璃棒攪拌 5min，靜置 1min 待雜質(zhì)沉降）。
2、半固體食品（如酸奶、果醬、醬料）
取樣 25g，放入無菌均質(zhì)杯（或均質(zhì)袋）中，加入 225mL 無菌生理鹽水（1:10 稀釋，10?¹）。
用均質(zhì)器攪拌 3~5min（或手動攪拌至無顆粒），確保樣品完全溶解，避免結(jié)塊（如酸奶需攪拌至無凝塊，果醬需打散顆粒）。
3、液體食品（如飲料、飲用水、醬油）
取樣 25mL，直接注入含 225mL 無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中（1:10 稀釋，10?¹），若樣品黏稠，需先加入少量無菌生理鹽水稀釋后再定容至 225mL。
用漩渦振蕩器振蕩 1min，或顛倒錐形瓶 10 次，充分混勻。
4、特殊食品（含防腐劑/高鹽/高糖食品）
如泡菜、咸菜（高鹽）：用無菌 PBS 緩沖液替代生理鹽水（避免高鹽疊加導(dǎo)致細(xì)菌死亡）；
如果汁、飲料（含防腐劑）：適當(dāng)增加稀釋倍數(shù)（如直接 1:100 稀釋），減少防腐劑對微生物的抑制作用。
關(guān)鍵注意：
樣品預(yù)處理需在采樣后 2h 內(nèi)完成，若無法及時檢測，需 4℃冷藏（不超過 24h），避免微生物死亡或增殖；
均質(zhì)過程避免樣品濺出，均質(zhì)袋/杯需保持無菌，操作后用酒精擦拭均質(zhì)器表面消毒。
三、梯度稀釋（10 倍系列稀釋，控制濃度范圍）
基于食品微生物污染程度調(diào)整稀釋梯度（常規(guī)食品選擇 10?¹~10??，高污染食品如變質(zhì)肉類可延伸至 10??，低污染食品如瓶裝水可至 10?³），操作如下：
試管標(biāo)記：取 5 支無菌試管，依次標(biāo)記 “10?²、10?³、10??、10??、10??”，每管加入 9mL 無菌生理鹽水。
系列稀釋：
用無菌移液管吸取 10?¹ 稀釋液（均質(zhì)后的懸液）1mL，在酒精燈火焰旁緩慢注入 10?² 試管中（移液管尖端貼壁，避免濺出）。
蓋緊試管蓋，用漩渦振蕩器振蕩 1min（或手捏試管顛倒 15 次），充分混勻，靜置 1min（氣泡消散）。
更換新的無菌移液管，從 10?² 試管中吸取 1mL 稀釋液，注入 10?³ 試管中，振蕩混勻；依次類推，完成 10?²~10??稀釋（每一步必須更換移液管，避免交叉污染）。
稀釋要點：
移液時吸量準(zhǔn)確（1mL 誤差≤0.05mL），避免稀釋倍數(shù)偏差；
高污染食品可在 10??后增加 10??稀釋（額外加 1 支 9mL 試管），低污染食品（如無菌飲用水）可只做 10?¹~10?³ 稀釋。
四、傾注平板與接種（確保菌落均勻分離）
培養(yǎng)皿標(biāo)記：取每個目標(biāo)稀釋度（如 10?³、10??、10??、10??）3 個無菌培養(yǎng)皿，清晰標(biāo)記樣品名稱、稀釋度、檢測項目（如“豬肉 - 10??- 細(xì)菌總數(shù)”）、日期、操作者。
培養(yǎng)基準(zhǔn)備：將滅菌后的固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂）放入沸水浴或微波爐中融化，冷卻至 45~50℃（手感不燙手，滴在手腕內(nèi)側(cè)無刺痛感），避免溫度過高殺死細(xì)菌，過低導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固。
接種菌液：
用無菌移液管吸取 0.1mL（或 1mL）對應(yīng)稀釋度的菌液，滴加到培養(yǎng)皿中央（滴加時移液管尖端靠近皿底，避免濺出）；
建議接種體積：高污染食品用 0.1mL（避免菌落過多），低污染食品用 1mL（提高檢出率），同一批樣品接種體積需統(tǒng)一。
傾注與混勻：
迅速將冷卻至 45℃的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿 15~20mL（剛好覆蓋皿底，厚度均勻）；
立即輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿（順時針 + 逆時針各 3 圈，幅度不宜過大），使菌液與培養(yǎng)基充分混合（避免菌液聚集在中央導(dǎo)致菌落重疊）；
若培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡，輕輕敲擊培養(yǎng)皿邊緣排出（氣泡會遮擋菌落或?qū)е滦螒B(tài)異常）。
凝固：將培養(yǎng)皿平放在超凈工作臺中，開蓋通風(fēng) 1~2min（去除冷凝水），蓋緊蓋子后倒置放置，待培養(yǎng)基完全凝固（約 15~20min，觸摸皿底無粘膩感）。
五、培養(yǎng)（按微生物類型控制條件，符合國標(biāo)要求）
將凝固后的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，按檢測目標(biāo)設(shè)置培養(yǎng)條件，避免溫度/時間偏差影響菌落生長：
檢測項目 培養(yǎng)基類型 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時間 備注
細(xì)菌總數(shù) 營養(yǎng)瓊脂（NA） 37℃ 48h±2h 有氧培養(yǎng)，適用于大多數(shù)細(xì)菌
霉菌酵母菌總數(shù) 孟加拉紅瓊脂 28℃ 72h±2h 有氧培養(yǎng)，避免光照直射
大腸桿菌計數(shù) 麥康凱瓊脂 37℃ 24h±2h 鑒別性培養(yǎng)，菌落呈紅色
沙門氏菌計數(shù) SS 瓊脂 37℃ 24~48h 選擇性培養(yǎng)，菌落呈無色透明
關(guān)鍵注意：
培養(yǎng)時培養(yǎng)皿需倒置（避免冷凝水滴落污染菌落或?qū)е戮鋽U散）；
霉菌酵母菌培養(yǎng)期間需保持培養(yǎng)箱內(nèi)濕度（可放一杯無菌水），避免培養(yǎng)基干裂；
嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時間，不足會導(dǎo)致菌落過小無法計數(shù)，過長會導(dǎo)致菌落重疊或雜菌過度生長。
六、菌落計數(shù)與結(jié)果計算（按國標(biāo)規(guī)范統(tǒng)計）
1、菌落觀察與篩選
培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，肉眼觀察菌落形態(tài)（如細(xì)菌菌落呈圓形、邊緣清晰，霉菌菌落呈絨毛狀、有顏色），排除雜菌（若出現(xiàn)與目標(biāo)菌落形態(tài)差異極大的菌落，需排查污染原因）。
選擇菌落數(shù)在 30~300 之間的平板進行計數(shù)（國標(biāo)規(guī)定該范圍統(tǒng)計結(jié)果最準(zhǔn)確，低于 30 誤差率＞10%，高于 300 菌落重疊無法區(qū)分）。
2、計數(shù)方法
肉眼計數(shù)：用記號筆標(biāo)記已計數(shù)的單菌落，避免漏數(shù)或重復(fù)計數(shù)；
輔助工具：用菌落計數(shù)器或放大鏡輔助計數(shù)，尤其適用于微小菌落、透明菌落；
特殊情況處理：
鏈狀生長的細(xì)菌（如
鏈球菌）：單鏈≤3 個細(xì)胞按 1 個菌落計數(shù)，＞3 個細(xì)胞需注明計數(shù)方式；
霉菌菌落：若菌絲蔓延，按“單個菌落形成單位”統(tǒng)計（即使菌絲相連，若源自單個孢子/菌絲片段，按 1 個計數(shù)）。
3、異常平板處理
同一稀釋度 3 個平板的菌落數(shù)差異過大（超出平均值的 ±20%），需剔除異常平板（如污染、菌落重疊嚴(yán)重）后重新計算平均值；若無法剔除，需重新實驗；
所有稀釋度平板菌落數(shù)均＜30：結(jié)果報告為“＜30 CFU/g（mL）”（需注明稀釋倍數(shù)）；
所有稀釋度平板菌落數(shù)均＞300：結(jié)果報告為“＞300 CFU/g（mL）”（或增加稀釋倍數(shù)重新實驗）；
空白對照：設(shè)置“無菌生理鹽水 + 培養(yǎng)基”的空白平板，同條件培養(yǎng)后若出現(xiàn)菌落，說明器材、試劑或操作污染，需重新實驗。
4、結(jié)果計算
核心公式（按國標(biāo)推導(dǎo)）：
每克（毫升）樣品中微生物數(shù)（CFU/g/mL）= 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積（mL）
示例：
檢測豬肉中細(xì)菌總數(shù)，10??稀釋度的 3 個平板菌落數(shù)分別為 52、48、55，接種體積 0.1mL：
平均菌落數(shù) =（52+48+55）/3 = 51.67 ≈ 52；
稀釋倍數(shù) = 10?（10?¹ 初始稀釋 + 10?²~10??梯度稀釋，總稀釋倍數(shù)為 10?）；
原始濃度 = 52 × 10? ÷ 0.1 = 5.2×10? CFU/g。
單位規(guī)范：
固體食品單位為 “CFU/g”，液體食品為 “CFU/mL”，不可簡寫為 “個 /g（mL）”；
結(jié)果保留 1~2 位有效數(shù)字，用科學(xué)計數(shù)法表示（如 5.2×10? CFU/g，而非 5200000 CFU/g）。
七、實驗后處理與記錄（符合檢測規(guī)范）
1、廢棄物處理
培養(yǎng)后的含菌平板、試管、移液管等需放入高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，30min）滅菌后，再按醫(yī)療廢棄物處理，避免微生物污染環(huán)境；
超凈工作臺臺面用 75% 酒精擦拭消毒，均質(zhì)器、移液器等器材清潔后紫外線消毒 30min。
2、結(jié)果記錄與報告
按食品檢測報告格式記錄以下信息，確保數(shù)據(jù)可追溯：
樣品信息：樣品名稱、批號、生產(chǎn)廠家、取樣時間、取樣地點；
實驗信息：稀釋梯度設(shè)置、各平板菌落數(shù)、平均菌落數(shù)、接種體積、稀釋倍數(shù)、原始濃度；
培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、氣體環(huán)境；
質(zhì)量控制：空白對照結(jié)果、平行樣誤差情況；
結(jié)果判定：是否符合對應(yīng)的食品衛(wèi)生國標(biāo)（如 GB 2726-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》規(guī)定，熟肉制品細(xì)菌總數(shù)≤8×10? CFU/g）。
八、食品檢測專屬注意事項（避免國標(biāo)不符與誤差）
樣品代表性：嚴(yán)格按國標(biāo)取樣（如隨機取樣、多點取樣），避免取污染嚴(yán)重或未污染的局部樣品，導(dǎo)致結(jié)果失真；
無菌操作強化：食品樣品易攜帶雜菌，所有操作需在超凈工作臺酒精燈火焰旁進行，培養(yǎng)皿開蓋時間≤10s，移液管、剪刀等器材使用前后需灼燒滅菌；
稀釋液選擇：高鹽/高糖/酸性食品（如泡菜、蜂蜜、果汁）需用無菌 PBS 緩沖液或中性稀釋液，避免滲透壓或 pH 沖擊導(dǎo)致細(xì)菌死亡；
培養(yǎng)基適配：致病菌計數(shù)必須使用選擇性/鑒別培養(yǎng)基（如大腸桿菌用麥康凱瓊脂、沙門氏菌用 SS 瓊脂），避免雜菌干擾計數(shù)；
國標(biāo)合規(guī)性：所有操作（如取樣量、稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)條件、計數(shù)范圍）需符合對應(yīng)的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（如 GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗 細(xì)菌總數(shù)測定》），確保結(jié)果具有法律效力。
總結(jié)
稀釋平板計數(shù)法在食品微生物檢測中的核心是“樣品均質(zhì)化 + 無菌操作 + 國標(biāo)化培養(yǎng) + 規(guī)范計數(shù)”，需針對食品類型（固體/液體/特殊食品）調(diào)整預(yù)處理和稀釋方案，同時嚴(yán)格遵循國標(biāo)要求控制培養(yǎng)條件和計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該方法能直觀反映食品中活菌污染水平，是食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制、市場監(jiān)管部門監(jiān)督抽檢的核心技術(shù)，實操中需重點關(guān)注樣品代表性、稀釋準(zhǔn)確性和無菌控制，避免因操作偏差導(dǎo)致結(jié)果不合格或誤判。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：食品微生物檢驗采樣方法：標(biāo)準(zhǔn)化流程與質(zhì)量控制！
下一篇：微生物檢測和分離純化實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的判斷標(biāo)準(zhǔn)是什么？