厭氧菌的篩選和鑒定方法之分離到確證的完整技術(shù)體系！
小楊 / 2025-11-21 10:37:11
厭氧菌的篩選與鑒定是微生物學(xué)研究、臨床診斷、工業(yè)應(yīng)用的核心環(huán)節(jié)，需遵循“選擇性分離→純化→表型鑒定→分子確證”的邏輯流程，核心目標(biāo)是從復(fù)雜樣品（如土壤、糞便、臨床標(biāo)本）中分離目標(biāo)厭氧菌，并通過(guò)多維度特征驗(yàn)證其物種身份。以下是結(jié)構(gòu)化、可操作的技術(shù)體系，涵蓋原理、步驟、關(guān)鍵要點(diǎn)及質(zhì)量控制。
一、厭氧菌的篩選方法（從樣品到純培養(yǎng)）
篩選的核心是抑制雜菌（尤其是需氧菌、兼性厭氧菌）生長(zhǎng)，富集目標(biāo)厭氧菌，依賴選擇性培養(yǎng)基、無(wú)氧環(huán)境及樣品預(yù)處理技術(shù)。
（一）樣品預(yù)處理（提高目標(biāo)菌檢出率）
根據(jù)樣品類型（如糞便、土壤、臨床膿液）選擇預(yù)處理方法，減少雜菌干擾并激活厭氧菌：
樣品類型 預(yù)處理方法 原理與目的 操作細(xì)節(jié)
糞便、土壤 梯度稀釋 + 熱休克 熱休克（80℃，10 min）殺死不耐熱雜菌，富集芽孢厭氧菌 1.樣品按 1:10 梯度稀釋；2.取稀釋液 80℃水浴 10 min，迅速冷卻后接種
臨床標(biāo)本（膿液、組織） 研磨均質(zhì)化 + 抗生素處理（可選） 抗生素抑制革蘭氏陰性雜菌，富集目標(biāo)厭氧菌 1.組織塊無(wú)菌研磨，加入無(wú)氧生理鹽水制成懸液；2.加入特定抗生素，室溫孵育 30 min
污水、沉積物 離心富集 + 去氧處理 離心濃縮細(xì)菌，去除樣品中溶解氧 1.8000 r/min 離心 10 min，收集沉淀；2.沉淀用含半胱氨酸的無(wú)氧生理鹽水重懸
（二）選擇性培養(yǎng)基篩選（核心手段）
通過(guò)添加抑制劑、特殊底物或營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)現(xiàn)“抑制雜菌 + 促進(jìn)目標(biāo)厭氧菌生長(zhǎng)”，常用培養(yǎng)基及應(yīng)用場(chǎng)景如下：
培養(yǎng)基名稱 核心成分與抑制劑 適用菌株 篩選原理
強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM） 蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、半胱氨酸 梭菌屬 高營(yíng)養(yǎng)成分滿足梭菌生長(zhǎng)，半胱氨酸維持還原環(huán)境
雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BSM） 乳糖、酵母提取物、萬(wàn)古霉素、鋰鹽 雙歧桿菌屬 雙歧桿菌可利用乳糖，萬(wàn)古霉素和鋰鹽抑制其他厭氧菌
擬桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBE） 膽汁鹽、七葉苷、檸檬酸鐵銨、萬(wàn)古霉素 擬桿菌屬 膽汁鹽耐受擬桿菌生長(zhǎng)，七葉苷水解產(chǎn)生黑色沉淀
產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)基（DSMZ 120） 乙酸、微量元素 產(chǎn)甲烷菌 提供產(chǎn)甲烷菌專屬碳源和還原環(huán)境，抑制非產(chǎn)甲烷菌
厭氧菌血瓊脂（ABA） 哥倫比亞瓊脂、羊血、萬(wàn)古霉素 + 多粘菌素 臨床厭氧菌 血瓊脂支持營(yíng)養(yǎng)需求，雙抗抑制需氧菌和革蘭氏陰性雜菌
篩選操作步驟：
培養(yǎng)基制備：按配方配置后，加入還原劑，高壓滅菌（121℃，15 min）；
無(wú)氧處理：培養(yǎng)基冷卻至 50℃時(shí)，通入無(wú)氧氣體（N?/CO?/H?=85:10:5）驅(qū)除溶解氧，倒平板（或分裝試管）；
接種：將預(yù)處理后的樣品接種到選擇性培養(yǎng)基（固體平板采用涂布法/劃線法，液體培養(yǎng)基采用傾注法）；
厭氧培養(yǎng)：置于厭氧罐/手套箱中，按菌株最適溫度培養(yǎng)（37℃ for 臨床厭氧菌，28℃ for 環(huán)境厭氧菌），培養(yǎng) 24~72 h（嚴(yán)格厭氧菌需 5~7 天）；
挑取候選菌落：選擇符合目標(biāo)菌株形態(tài)特征的菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)（劃線分離 2~3 代，獲得純培養(yǎng)）。
（三）無(wú)氧環(huán)境下的篩選輔助技術(shù)
溶血試驗(yàn)篩選：在血瓊脂平板上，厭氧菌（如
產(chǎn)氣莢膜梭菌）可產(chǎn)生溶血素，形成 α- 溶血（不完全溶血）或 β- 溶血（完全溶血），可作為初步篩選依據(jù)；
色素產(chǎn)生篩選：部分厭氧菌在血瓊脂上培養(yǎng)后，菌落會(huì)產(chǎn)生黑色素（黑色或棕色），可直接識(shí)別；
氣體產(chǎn)生篩選：液體培養(yǎng)基中加入 Durham 管，厭氧菌發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生氣體（如 CO?、H?），可觀察到 Durham 管內(nèi)有氣泡，作為生長(zhǎng)陽(yáng)性指標(biāo)。
二、厭氧菌的鑒定方法（從表型到分子確證）
鑒定的核心是通過(guò)“表型特征 + 分子特征”雙重驗(yàn)證，確保物種鑒定的準(zhǔn)確性。按鑒定層次可分為初級(jí)鑒定（表型）和高級(jí)鑒定（分子 + 生化）。
（一）初級(jí)鑒定：表型特征分析（快速初步歸類）
通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征，對(duì)厭氧菌進(jìn)行屬水平初步鑒定，適用于大規(guī)模篩選或資源普查。
1、形態(tài)學(xué)鑒定
菌落形態(tài)觀察：記錄菌落大小、形狀、顏色、邊緣、隆起度、溶血情況（血瓊脂平板）；
細(xì)胞形態(tài)與染色：
革蘭氏染色：厭氧菌多為革蘭氏陽(yáng)性（如
梭菌、
雙歧桿菌）或革蘭氏陰性（如
擬桿菌、
梭桿菌），需注意：革蘭氏陰性厭氧菌染色時(shí)避免脫色過(guò)度（用 95% 乙醇脫色 10~15 s）；
顯微鏡觀察：用相差顯微鏡或暗視野顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)（避免染色導(dǎo)致細(xì)胞損傷）。
2、生理生化特征鑒定
通過(guò)檢測(cè)厭氧菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力、代謝產(chǎn)物類型，實(shí)現(xiàn)屬/種水平鑒定，常用方法如下：
鑒定項(xiàng)目 檢測(cè)方法 結(jié)果判斷與意義 適用菌株
碳源利用試驗(yàn) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含指示劑溴甲酚紫）中添加不同碳源 細(xì)菌利用碳源產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由紫變黃為陽(yáng)性；可區(qū)分不同種 雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌
糖發(fā)酵試驗(yàn) API 20A 試劑盒（厭氧菌專用） 試劑盒含 20 種生化反應(yīng)，通過(guò)反應(yīng)模式與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定 臨床厭氧菌（如
脆弱擬桿菌、
消化鏈球菌）
酶活性檢測(cè) 觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn) 觸酶試驗(yàn)：產(chǎn)氣為陽(yáng)性；脲酶試驗(yàn)：培養(yǎng)基變紅為陽(yáng)性 所有厭氧菌（用于排除雜菌和初步歸類）
代謝產(chǎn)物分析（VFA 檢測(cè)） 氣相色譜法（GC）檢測(cè)發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸 不同厭氧菌代謝產(chǎn)物譜不同 腸道厭氧菌、環(huán)境厭氧菌
膽汁耐受試驗(yàn) 培養(yǎng)基中添加 0.1%~0.5% 膽汁鹽 能生長(zhǎng)為陽(yáng)性 區(qū)分腸道厭氧菌與非腸道厭氧菌
操作要點(diǎn)：
所有生化試驗(yàn)需在無(wú)氧環(huán)境下進(jìn)行，避免氧氣影響酶活性；
培養(yǎng)基需添加還原劑，維持還原環(huán)境；
結(jié)果判斷需結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照（空白培養(yǎng)基）。
（二）高級(jí)鑒定：分子生物學(xué)方法（精準(zhǔn)確證）
針對(duì)表型鑒定難以區(qū)分的菌株，通過(guò)分析遺傳物質(zhì)（DNA/RNA）實(shí)現(xiàn)種水平精準(zhǔn)鑒定，是目前最可靠的鑒定手段。
1、16S rRNA 基因測(cè)序（金標(biāo)準(zhǔn)方法）
原理：16S rRNA 基因是細(xì)菌的“分子身份證”，保守區(qū)序列用于屬水平鑒定，可變區(qū)序列用于種水平區(qū)分，通過(guò)測(cè)序結(jié)果與 NCBI、EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定物種身份。
操作步驟：
基因組 DNA 提?。翰捎脜捬蹙鷮Ｓ?DNA 提取試劑盒，避免氧氣暴露導(dǎo)致 DNA 降解；
16S rRNA 基因擴(kuò)增：使用厭氧菌特異性引物，PCR 反應(yīng)體系需添加 DMSO（5%）提高擴(kuò)增效率；
測(cè)序與比對(duì)：PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行 Sanger 測(cè)序（純培養(yǎng)菌株）或高通量測(cè)序（混合菌株），測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，相似度≥97% 為同屬，≥99% 為同種。
優(yōu)勢(shì)：精準(zhǔn)度高，可鑒定表型難以區(qū)分的菌株；
注意事項(xiàng)：避免 DNA 提取過(guò)程中污染（如環(huán)境細(xì)菌 DNA），需設(shè)置陰性對(duì)照。
2、特異性基因擴(kuò)增（PCR 鑒定）
原理：針對(duì)目標(biāo)菌株的特異性基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增判斷是否為目標(biāo)菌株。
應(yīng)用場(chǎng)景：快速鑒定特定致病菌。
操作步驟：提取基因組 DNA → 特異性引物 PCR 擴(kuò)增 → 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) → 陽(yáng)性條帶出現(xiàn)即為目標(biāo)菌株。
3、全基因組測(cè)序（WGS）
原理：測(cè)定菌株全基因組序列，通過(guò)比較基因組分析，ANI≥95% 為同種菌株。
優(yōu)勢(shì)：可同時(shí)獲得物種鑒定、功能基因、毒力基因、耐藥基因等信息，適用于菌株分型、進(jìn)化分析；
應(yīng)用場(chǎng)景：科研領(lǐng)域的精準(zhǔn)鑒定、臨床耐藥菌株溯源、工業(yè)菌株篩選。
4、其他分子方法
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）：通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割 16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物，不同菌株酶切圖譜不同，用于菌株分型；
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）：可同時(shí)實(shí)現(xiàn)鑒定與定量，適用于樣品中目標(biāo)厭氧菌的快速檢測(cè)。
（三）表型與分子結(jié)合的鑒定流程（推薦方案）
純培養(yǎng)菌株 → 形態(tài)學(xué)觀察（革蘭氏染色、菌落形態(tài)）→ 觸酶試驗(yàn)（排除需氧菌雜菌）；
生化鑒定（API 20A 試劑盒或碳源利用試驗(yàn)）→ 初步歸類至屬/種；
分子確證（16S rRNA 基因測(cè)序）→ 與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定物種身份；
特殊需求（如致病菌鑒定）→ 特異性基因 PCR 或 WGS 分析 → 驗(yàn)證毒力/耐藥特征。
三、關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)與質(zhì)量控制（提高鑒定準(zhǔn)確性）
1、純培養(yǎng)質(zhì)量控制
篩選后需通過(guò)劃線分離 2~3 代，確保菌落形態(tài)均一（純培養(yǎng)），避免混合菌株導(dǎo)致鑒定結(jié)果偏差；
純培養(yǎng)菌株需在厭氧環(huán)境下短期保藏（如 4℃ 厭氧罐保存，1 周內(nèi)完成鑒定），避免菌株活力下降或表型改變。
2、試劑與設(shè)備質(zhì)量控制
生化試劑盒需在有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，設(shè)置陽(yáng)性/陰性對(duì)照；
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，PCR 反應(yīng)需設(shè)置空白對(duì)照（無(wú)模板）和陽(yáng)性對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)菌株 DNA），避免假陽(yáng)性/假陰性。
3、結(jié)果驗(yàn)證與重復(fù)
表型鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果需相互驗(yàn)證，若出現(xiàn)矛盾（如表型歸類為梭菌屬，16S 測(cè)序?yàn)殡p歧桿菌屬），需重新提取 DNA 測(cè)序或重復(fù)生化試驗(yàn)；
關(guān)鍵菌株（如臨床致病菌、工業(yè)生產(chǎn)菌株）需進(jìn)行至少 2 次獨(dú)立鑒定，確保結(jié)果可靠。
4、避免雜菌干擾
樣品預(yù)處理和接種過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免需氧菌/兼性厭氧菌污染；
若鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雜菌（如菌落形態(tài)不一致、觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性），需重新篩選純化。
四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
問(wèn)題類型 可能原因 解決方案
篩選后無(wú)目標(biāo)菌落生長(zhǎng) 1.無(wú)氧環(huán)境構(gòu)建失?。?.選擇性培養(yǎng)基抑制劑濃度過(guò)高；3.樣品中目標(biāo)菌含量低 1.檢查厭氧指示劑，更換產(chǎn)氣包/手套箱氣體；2.降低抑制劑濃度；3.增加樣品接種量，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間
生化試驗(yàn)結(jié)果模糊 1.菌株活力不足；2.培養(yǎng)時(shí)間不足；3.氧氣影響酶活性 1.復(fù)蘇菌株（活化 1~2 代）；2.延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間；3.在厭氧手套箱內(nèi)進(jìn)行接種和結(jié)果判讀
表型與分子鑒定結(jié)果矛盾 1.菌株表型變異；2.測(cè)序錯(cuò)誤；3.生化試驗(yàn)操作失誤 1.重復(fù)表型鑒定（更換批次培養(yǎng)基）；2.重新測(cè)序驗(yàn)證；3.嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，設(shè)置對(duì)照
五、應(yīng)用場(chǎng)景與技術(shù)選擇
應(yīng)用場(chǎng)景 推薦鑒定方法組合 核心需求與優(yōu)勢(shì)
臨床診斷 形態(tài)學(xué) + API 20A 生化鑒定 + 特異性基因 PCR 快速準(zhǔn)確，可同時(shí)鑒定致病菌和毒力基因
科研資源普查 形態(tài)學(xué) + 16S rRNA 基因測(cè)序 高通量，可實(shí)現(xiàn)屬/種水平精準(zhǔn)鑒定
工業(yè)益生菌篩選 形態(tài)學(xué) + 碳源利用試驗(yàn) + 16S rRNA 測(cè)序 + VFA 代謝分析 兼顧物種鑒定和功能驗(yàn)證
新物種發(fā)現(xiàn)與命名 形態(tài)學(xué) + 多相分類（生化 + 16S rRNA 測(cè)序 + WGS+DNA-DNA 雜交） 滿足國(guó)際細(xì)菌命名標(biāo)準(zhǔn)，確保分類地位準(zhǔn)確
六、技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)
隨著微生物組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，厭氧菌鑒定正向快速化、高通量、精準(zhǔn)化方向發(fā)展：
微流控技術(shù)：實(shí)現(xiàn)“篩選 - 鑒定 - 定量”一體化，單次可檢測(cè)數(shù)百個(gè)菌株；
宏基因組測(cè)序：無(wú)需純培養(yǎng)，直接從樣品中鑒定厭氧菌物種組成（適用于復(fù)雜樣品如腸道微生物組）；
AI 輔助鑒定：通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析菌落形態(tài)、生化反應(yīng)模式，快速匹配物種信息；
便攜式檢測(cè)設(shè)備：適用于現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定（如臨床床旁檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)）。
綜上，
厭氧菌的篩選與鑒定需結(jié)合樣品特性、目標(biāo)菌株類型及應(yīng)用需求，選擇“選擇性篩選 + 表型初步鑒定 + 分子精準(zhǔn)確證”的組合方案，同時(shí)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程的質(zhì)量，確保結(jié)果可靠、可重復(fù)。
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