傾倒平皿法的實驗原理與操作流程及應用場景與質量控制！
小楊 / 2025-11-25 10:17:14
百歐博偉生物：傾倒平皿法（又稱傾注平板法）是微生物學中分離純化、菌落計數(shù)、菌種保藏的核心技術之一，通過將融化的固體培養(yǎng)基與稀釋后的微生物樣品充分混合，冷卻凝固后形成均勻的菌落分布，適用于細菌、酵母菌等兼性厭氧或厭氧微生物的培養(yǎng)與分析。其核心優(yōu)勢是菌落分布均勻、計數(shù)結果準確，且能分離出單個菌落用于純培養(yǎng)。
一、實驗原理
稀釋梯度制備：將含微生物的樣品進行系列梯度稀釋（如 10?¹~10??），降低樣品中微生物濃度，避免菌落重疊。
培養(yǎng)基混合：取一定體積的稀釋液與融化后冷卻至 45~50℃的固體培養(yǎng)基（如 LB、營養(yǎng)瓊脂）充分混合，確保微生物均勻分散在培養(yǎng)基中。
凝固與培養(yǎng)：混合液倒入無菌平皿后冷卻凝固，微生物被固定在培養(yǎng)基內部或表面，經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后形成單個菌落，可用于計數(shù)或純化。
二、核心應用場景
微生物計數(shù)：適用于食品、水體、土壤、臨床樣本等的總菌數(shù)或特定菌數(shù)定量（如菌落形成單位 CFU/mL）。
菌種分離純化：從混合菌群中分離單個菌落，獲得純培養(yǎng)物（尤其適用于厭氧菌，避免氧氣暴露）。
菌種保藏：將純培養(yǎng)的菌落接種到傾注平板上，培養(yǎng)后 4℃短期保藏或制成凍存管長期保藏。
藥敏試驗：部分微生物的藥敏測試可通過傾注平板法進行，觀察藥物對菌落生長的抑制圈。
三、詳細操作流程（以細菌計數(shù)為例）
（一）實驗材料準備
培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基（如 LB 瓊脂、營養(yǎng)瓊脂），根據(jù)目標微生物調整（如真菌用 PDA 培養(yǎng)基，厭氧菌用厭氧瓊脂）。
樣品：待檢測樣品（如土壤懸液、水體、食品勻漿）。
器材：無菌平皿（直徑 90mm）、無菌移液管（1mL、10mL）、無菌離心管/試管、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋（50℃）。
輔助試劑：無菌生理鹽水（0.85% NaCl）、稀釋液（根據(jù)樣品調整）。
（二）操作步驟
1、培養(yǎng)基制備與融化
按配方配制固體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌（121℃，15~20min）。
滅菌后將培養(yǎng)基放入 50℃水浴鍋中保溫，避免凝固（溫度過高會殺死微生物，過低則提前凝固無法混合）。
2、樣品梯度稀釋（關鍵步驟）
無菌操作：全程在超凈工作臺或無菌環(huán)境中進行，避免雜菌污染。
初始稀釋：取 1mL 待檢測樣品，加入 9mL 無菌生理鹽水（或稀釋液）中，漩渦振蕩 1~2min，制成 10?¹ 稀釋液。
系列稀釋：從 10?¹ 稀釋液中取 1mL，加入新的 9mL 無菌生理鹽水，振蕩均勻，制成 10?² 稀釋液；依次類推，制備 10?³~10??梯度稀釋液（根據(jù)樣品菌濃度調整稀釋梯度，最終平板菌落數(shù)控制在 30~300 個，便于計數(shù)）。
注意：每換一個稀釋梯度，需更換新的無菌移液管，避免交叉污染；振蕩時確保樣品與稀釋液充分混合，避免微生物聚集。
3、傾注平板操作
平皿標記：在無菌平皿底部標記樣品名稱、稀釋梯度、日期（避免在皿蓋標記，防止冷凝水滴落污染）。
加樣：用無菌移液管吸取 0.1~1mL（常用 0.1mL）特定稀釋度的稀釋液，滴加到對應標記的無菌平皿中央（每個稀釋度做 3 個平行重復，提高準確性）。
倒培養(yǎng)基：從水浴鍋中取出融化的培養(yǎng)基（溫度約 45~50℃，手感不燙手），迅速倒入平皿中，每皿倒入約 15~20mL（剛好覆蓋平皿底部，厚度均勻）。
混合均勻：立即將平皿輕輕旋轉（順時針 + 逆時針各 3~5 圈），使稀釋液與培養(yǎng)基充分混合，避免局部微生物濃度過高（注意不要劇烈晃動，防止培養(yǎng)基溢出或產(chǎn)生氣泡）。
凝固：將平皿水平放置在超凈工作臺中，室溫下靜置 15~30min，待培養(yǎng)基完全凝固（避免移動，防止菌落分布不均）。
4、培養(yǎng)
凝固后，將平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中（倒置可避免冷凝水滴落污染菌落，影響觀察）。
培養(yǎng)條件：細菌一般 37℃培養(yǎng) 18~24h；酵母菌 28℃培養(yǎng) 48~72h；真菌 25~28℃培養(yǎng) 3~5d（根據(jù)目標微生物調整溫度和時間）。
5、菌落計數(shù)與結果分析
培養(yǎng)結束后，選取菌落數(shù)在 30~300 個的平板進行計數(shù)（菌落數(shù)過多易重疊，過少則誤差大）。
計算方法：每毫升樣品中的菌落形成單位（CFU/mL）= 平板平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積（mL）。
示例：若 10??稀釋液接種 0.1mL，3 個平行平板的菌落數(shù)分別為 85、92、88，則平均菌落數(shù) =（85+92+88）/3=88.3≈88；CFU/mL=88 × 10? ÷ 0.1=8.8×10?。
四、關鍵注意事項（避免實驗失敗的核心要點）
1、無菌操作規(guī)范
所有器材（平皿、移液管、試管）需徹底滅菌，培養(yǎng)基滅菌后需冷卻至 45~50℃再使用，避免高溫殺死樣品中的微生物。
操作時避免手、頭發(fā)等接觸無菌區(qū)域，移液管吸取液體時需在酒精燈火焰附近操作，防止雜菌污染。
稀釋過程中，每一步振蕩要充分，確保微生物均勻分散，避免“抱團”導致菌落計數(shù)偏低。
2、培養(yǎng)基溫度控制
培養(yǎng)基溫度過高（>60℃）：會燙傷微生物，導致計數(shù)結果偏低；溫度過低（<40℃）：培養(yǎng)基易凝固，無法與稀釋液充分混合，形成局部菌落聚集。
若培養(yǎng)基凝固，可重新放入沸水浴中融化，但融化次數(shù)不宜超過 2 次（避免營養(yǎng)成分破壞或瓊脂降解）。
3、稀釋梯度選擇
樣品菌濃度未知時，需設置多個稀釋梯度（如 10?³~10??），確保至少有一個梯度的平板菌落數(shù)在 30~300 個范圍內。
若樣品菌濃度過高，可增加稀釋梯度（如 10??~10??）；若菌濃度過低（如純凈水、無菌樣品），可減少稀釋梯度（如 10?¹~10?³）。
4、平板凝固與培養(yǎng)
培養(yǎng)基凝固時需水平放置，避免傾斜導致培養(yǎng)基厚度不均，影響菌落生長。
培養(yǎng)時必須倒置平皿，防止冷凝水滴落沖散菌落或造成污染。
培養(yǎng)時間需充足但不過度：細菌培養(yǎng)不足會導致菌落過小無法計數(shù)，過度培養(yǎng)會導致菌落重疊；真菌培養(yǎng)時間需根據(jù)菌種調整，避免菌絲蔓延。
5、污染處理
若平板出現(xiàn)雜菌菌落（形態(tài)與目標菌落差異明顯），需排查無菌操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基是否污染、樣品是否本身含雜菌。
若所有平行平板均污染，需重新滅菌器材和培養(yǎng)基，更換無菌稀釋液后重試。
五、質量控制要點
空白對照：每個實驗需設置空白對照（僅傾注培養(yǎng)基，不接種樣品），若空白平板出現(xiàn)菌落，說明實驗環(huán)境或器材存在污染，需重新實驗。
平行重復：每個稀釋度至少做 3 個平行平板，計算平均菌落數(shù)，減少隨機誤差（平行平板菌落數(shù)差異應≤10%，否則需重新稀釋接種）。
菌落計數(shù)規(guī)范：
僅計數(shù)形態(tài)一致、邊緣清晰的單個菌落，粘連的菌落若無法區(qū)分，不計入總數(shù)。
若平板菌落數(shù)超過 300 個，記為“多不可計（TMTC）”；低于 30 個，記為“少不可計（TFTC）”，均不用于計算。
培養(yǎng)基質量檢查：滅菌后的培養(yǎng)基需觀察外觀（無渾濁、無沉淀、顏色正常），接種標準菌株（如
大腸桿菌 ATCC 25922）驗證其營養(yǎng)適用性，確保菌落能正常生長。
六、常見問題與解決方案
問題現(xiàn)象 可能原因 解決方案
平板無菌落生長 1.樣品中無微生物；2.培養(yǎng)基溫度過高殺死微生物；3.稀釋梯度過高 1.更換樣品或增加接種體積；2.嚴格控制培養(yǎng)基溫度；3.降低稀釋梯度
菌落重疊嚴重 1.稀釋梯度過低，菌濃度過高；2.混合時未充分振蕩 1.增加稀釋梯度；2.稀釋和混合時充分振蕩，確保微生物分散
雜菌污染 1.無菌操作不規(guī)范；2.器材/培養(yǎng)基滅菌不徹底；3.樣品本身含雜菌 1.嚴格無菌操作；2.重新滅菌器材和培養(yǎng)基；3.若樣品含雜菌，需先進行選擇性富集或分離
菌落計數(shù)結果偏差大 1.平行平板數(shù)量不足；2.稀釋過程不均勻；3.計數(shù)時誤判菌落 1.每個稀釋度做 3~5 個平行；2.稀釋時充分振蕩，避免微生物聚集；3.統(tǒng)一菌落判斷標準，僅計數(shù)單個清晰菌落
七、拓展應用：針對不同微生物的優(yōu)化
1、厭氧菌培養(yǎng)：
培養(yǎng)基需預先除氧（煮沸后冷卻，通入氮氣或二氧化碳），傾注平板后立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱或厭氧袋中培養(yǎng)，避免氧氣抑制微生物生長。
2、真菌分離：
采用 PDA 培養(yǎng)基，添加氯霉素（50μg/mL）抑制細菌污染，培養(yǎng)溫度 25~28℃，時間 3~7d，計數(shù)時區(qū)分真菌菌落（多為絨毛狀、絮狀）與細菌菌落。
3、選擇性分離：
在培養(yǎng)基中添加特定抑制劑或底物（如分離
大腸桿菌時添加伊紅美藍，分離乳酸菌時添加萬古霉素），抑制雜菌生長，僅讓目標微生物形成菌落。
通過以上規(guī)范操作和質量控制，傾倒平皿法可高效實現(xiàn)微生物的分離、計數(shù)與純化，是微生物學實驗中最基礎且核心的技術之一，廣泛應用于科研、臨床檢測、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領域。
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