奶酪中常見微生物的分離方法與培養(yǎng)條件及質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-12-04 10:30:36
一、基于培養(yǎng)基選擇性的分離方法（最常用）
1、乳酸菌分離（奶酪中優(yōu)勢菌，包括乳酸球菌、乳酸桿菌）
核心原理：利用乳酸菌耐酸、發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的特性，通過選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌（如革蘭氏陰性菌、真菌）生長。
培養(yǎng)基選擇：
MRS 培養(yǎng)基（分離乳酸桿菌）：含牛肉膏、蛋白胨、乳糖，添加乙酸鈉（抑制真菌和革蘭氏陰性菌）、吐溫 80（促進乳酸菌生長），pH 6.2-6.4；
M17 培養(yǎng)基（分離乳酸球菌）：含 β- 甘油磷酸二鈉（緩沖 pH）、乳糖，適合乳球菌（如乳酸乳球菌）生長，抑制乳桿菌；
選擇性改良：若需分離耐鹽乳酸菌，可添加 2%-4% NaCl；若需排除酵母菌，添加 0.01% 氯霉素。
操作步驟：
取梯度稀釋后的奶酪菌懸液（10??~10??）0.1 mL，涂布于 MRS/M17 平板；
厭氧培養(yǎng)（80% N?+10% CO?+10% H?），30-37℃培養(yǎng) 48-72 h；
挑取圓形、乳白色、邊緣整齊的菌落，劃線純化 2-3 代，獲得純菌株。
2、霉菌/酵母分離
核心原理：利用真菌耐酸、耐放線菌酮的特性，抑制細菌生長。
培養(yǎng)基選擇：
PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）：基礎(chǔ)真菌培養(yǎng)基，添加 0.1% 氯霉素/鏈霉素（抑制細菌）、0.05% 放線菌酮（抑制部分霉菌雜菌）；
YPD 培養(yǎng)基（分離酵母）：含酵母粉、蛋白胨、葡萄糖，pH 5.6，添加氯霉素抑制細菌；
選擇性改良：分離耐鹽酵母可添加 5%-10% NaCl；分離產(chǎn)蛋白酶霉菌可添加酪蛋白作為唯一氮源。
操作步驟：
取 10?²~10??稀釋液 0.1 mL 涂布平板，25-28℃有氧培養(yǎng)（霉菌 5-7 d，酵母 2-3 d）；
霉菌挑取帶特征菌絲/孢子的菌落（如青霉呈藍綠色、毛霉呈白色棉絮狀），酵母挑取乳白色、濕潤的菌落；
霉菌用插片法純化，酵母用劃線法純化，直至菌落形態(tài)均一。
（1）李斯特菌
培養(yǎng)基：PALCAM 瓊脂（抑制革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌）、牛津瓊脂；
操作：取 10?¹~10?³ 稀釋液涂布，37℃需氧/微需氧培養(yǎng) 24-48 h，挑取黑色、周圍有暈圈的菌落純化。
（2）金黃色葡萄球菌
培養(yǎng)基：Baird-Parker 瓊脂（含卵黃、亞碲酸鉀，葡萄球菌還原亞碲酸鉀形成黑色菌落）；
操作：添加 7.5% NaCl 的肉湯預(yù)增菌（抑制雜菌），37℃培養(yǎng) 18 h 后涂布平板，挑取黑色、有光澤的菌落純化。
二、基于培養(yǎng)條件的分離方法（輔助篩選）
1、厭氧/微需氧分離法
適用菌：乳酸菌、雙歧桿菌（奶酪中部分益生菌）；
方法：
厭氧罐/厭氧工作站培養(yǎng)：使用厭氧產(chǎn)氣袋（生成 H?+CO?，鈀催化劑還原 O?），嚴格厭氧環(huán)境；
微需氧分離：5%-10% CO?環(huán)境（如 CO?培養(yǎng)箱），適合彎曲菌等微需氧菌（奶酪中偶見污染菌）。
2、溫度選擇性分離法
原理：利用不同微生物最適生長溫度差異篩選；
應(yīng)用：
低溫培養(yǎng)（10-15℃）：分離奶酪中低溫耐受的酵母/霉菌（如
假絲酵母）；
3、滲透壓選擇性分離法
原理：奶酪高鹽環(huán)境，耐鹽菌可在高滲培養(yǎng)基中生長；
應(yīng)用：分離耐鹽葡萄球菌、鹽耐受酵母時，在培養(yǎng)基中添加 5%-15% NaCl，抑制不耐鹽微生物。
三、特殊分離方法（針對難培養(yǎng)/微量菌）
1、預(yù)增菌分離法
適用場景：奶酪中目標菌含量極低、受雜菌抑制；
方法：先將稀釋液接種至液體選擇性培養(yǎng)基（如
李斯特菌的 FB1 增菌液、
葡萄球菌的 7.5% NaCl 肉湯），37℃培養(yǎng) 18-24 h，使目標菌增殖后再涂布平板分離，提高檢出率。
2、梯度稀釋涂布 + 平板劃線結(jié)合法
核心步驟：
梯度稀釋后涂布，獲得單菌落密集度適中的平板；
用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，在新鮮選擇性培養(yǎng)基上連續(xù)劃線（至少 3 次），每次劃線僅挑取前一次劃線末端的菌落，直至菌落形態(tài)、鏡檢特征完全一致，確保純培養(yǎng)。
3、顯微操作分離法（精準分離）
適用場景：需分離特定形態(tài)的微生物（如奶酪中與脂肪球結(jié)合的乳酸菌）；
方法：在顯微鏡下用顯微操作針挑取單個細胞/孢子，接種至微滴培養(yǎng)基中培養(yǎng)，適合稀有菌或難分離菌，但操作要求高、耗時。
四、分離過程的質(zhì)量控制
空白對照：每批次實驗設(shè)置培養(yǎng)基空白（僅培養(yǎng)基，無樣品），若有菌落生長，說明培養(yǎng)基/操作污染，實驗無效；
純度驗證：分離后的菌株需鏡檢（革蘭氏染色、孢子形態(tài)觀察）+ 生化鑒定（如乳酸菌發(fā)酵糖類、葡萄球菌凝固酶試驗），確認無雜菌；
培養(yǎng)時間：避免培養(yǎng)過久導(dǎo)致菌落重疊（乳酸菌≤72 h，霉菌≤7 d），影響分離準確性。
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