食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測方法與操作流程及質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-12-10 10:28:01
百歐博偉生物：食品中
單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱
單增李斯特菌）的檢測方法需滿足特異性強、靈敏度高、快速高效的要求，核心目標是從復雜食品基質(zhì)中準確分離、鑒定該菌，避免假陽性/假陰性結(jié)果。以下按傳統(tǒng)標準方法、快速檢測方法、分子生物學方法、其他新型檢測技術(shù)分類，結(jié)合其原理、操作流程、適用場景及優(yōu)缺點詳細解析，同時補充關(guān)鍵質(zhì)量控制要點：
一、傳統(tǒng)標準方法（國標/國際標準首選，金標準）
傳統(tǒng)方法基于分離培養(yǎng) + 生化鑒定，是食品微生物檢測的“金標準”，符合 GB 4789.30-2022（中國國標）、ISO 11290-1:2017（國際標準），適用于官方檢測、仲裁及實驗室常規(guī)篩查。
1、核心原理
利用
單增李斯特菌的嗜冷性、耐鹽性、特定生化特性，通過“增菌→分離→純化→鑒定”四步流程，從食品基質(zhì)中選擇性富集目標菌，排除雜菌干擾，最終通過生化反應確認。
2、操作流程（以 GB 4789.30-2022 為例）
（1）樣品前處理
稱取 25g 食品樣品（固體，如肉類、蔬菜）或 25mL 液體樣品（如牛奶、飲料），加入 225mL 緩沖蛋白胨水（BPW），均質(zhì)器均質(zhì) 1-2 分鐘，制成 1:10 稀釋液。
目的：分散樣品基質(zhì)，初步稀釋抑菌物質(zhì)（如食品中的鹽分、防腐劑）。
（2）增菌培養(yǎng)（關(guān)鍵步驟：富集目標菌，抑制雜菌）
一級增菌：將稀釋液置于 30℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h（需氧培養(yǎng)），BPW 為非選擇性增菌液，可促進單增李斯特菌復蘇和初步增殖。
二級增菌：取 1mL 一級增菌液，接種至 10mL Fraser 肉湯（選擇性增菌液，含吖啶黃素等抑制劑，抑制革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性雜菌），37℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h；若為冷凍食品，需延長至 48h。
關(guān)鍵：肉湯中含七葉苷，單增李斯特菌可水解七葉苷生成黑色產(chǎn)物，使肉湯變渾濁并呈黑色，可作為初步陽性指示。
（3）分離培養(yǎng)（選擇性分離目標菌）
取二級增菌液，分別劃線接種至牛津瓊脂（OXA） 和PALCAM 瓊脂（兩種選擇性培養(yǎng)基，國標推薦），37℃±1℃培養(yǎng) 24h-48h。
典型菌落特征：
牛津瓊脂：菌落呈黑色，周圍有黑色暈圈（水解七葉苷），菌落直徑 1-2mm，邊緣整齊。
PALCAM 瓊脂：菌落呈灰綠色，周圍有棕黑色暈圈，菌落中心可能有黑色沉淀。
（4）純化與生化鑒定
挑取 2-3 個典型菌落，接種至腦心浸液瓊脂（BHI），37℃培養(yǎng) 24h 純化，獲得純培養(yǎng)物。
生化鑒定（核心指標，需滿足以下全部陽性）：
形態(tài)：革蘭氏陽性小桿菌，無芽孢，22-25℃培養(yǎng)有動力（翻跟斗運動），37℃動力減弱。
生化反應：觸酶陽性、氧化酶陰性、VP 試驗陽性、甲基紅試驗陽性、精氨酸水解陽性；發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵木糖、甘露醇。
溶血試驗：接種至羊血瓊脂，37℃培養(yǎng) 24h，出現(xiàn) β- 溶血環(huán)（關(guān)鍵毒力相關(guān)特征，區(qū)分于無害李斯特菌屬其他物種）。
（5）血清學鑒定（可選，進一步確認血清型）
單增李斯特菌主要血清型為 1/2a、1/2b、1/2c、4b（占食品污染的 90% 以上），通過特異性抗血清進行玻片凝集試驗，確認血清型（適用于爆發(fā)疫情溯源）。
3、適用場景與優(yōu)缺點
優(yōu)點 缺點 適用場景
特異性高（生化 + 溶血試驗雙重驗證，假陽性率低） 耗時久（全程 4-7 天） 官方監(jiān)管、仲裁檢測、實驗室常規(guī)篩查
成本低（培養(yǎng)基和試劑廉價易獲?。?nbsp; 操作繁瑣（多步增菌、分離、生化反應） 食品企業(yè)出廠檢驗、第三方檢測機構(gòu)
結(jié)果可靠（國際公認金標準） 依賴專業(yè)技術(shù)人員（生化反應判斷需經(jīng)驗） 爆發(fā)疫情溯源（結(jié)合血清學鑒定）
二、快速檢測方法（食品企業(yè)現(xiàn)場篩查、應急檢測首選）
快速方法基于免疫學、色譜或生物傳感器技術(shù)，縮短檢測周期至 1-24h，適用于食品企業(yè)生產(chǎn)線快速篩查、應急疫情處置，需與傳統(tǒng)方法互補（快速方法陽性結(jié)果需傳統(tǒng)方法確認）。
1、免疫膠體金層析法
（1）原理
利用抗原 - 抗體特異性結(jié)合，將單增李斯特菌特異性抗體固定在硝酸纖維素膜檢測線，膠體金標記抗體作為探針，樣品中目標菌與探針結(jié)合后，在檢測線形成紅色條帶，實現(xiàn)可視化檢測。
（2）操作流程
樣品前處理：食品樣品均質(zhì)后，經(jīng) 80℃加熱 10 分鐘（滅活雜菌，保留單增李斯特菌抗原），取上清液作為檢測樣本。
檢測：將樣本滴加至試紙條加樣孔，室溫反應 10-15 分鐘，觀察檢測線和質(zhì)控線（質(zhì)控線顯色為有效結(jié)果）。
結(jié)果判斷：檢測線 + 質(zhì)控線均顯色為陽性；僅質(zhì)控線顯色為陰性；質(zhì)控線不顯色為無效。
（3）優(yōu)缺點與適用場景
優(yōu)點：快速（15-30 分鐘）、操作簡便（無需專業(yè)設備）、成本低、肉眼可讀。
缺點：靈敏度較低（檢測限約 10?-10? CFU/mL，需初步增菌）、易受食品基質(zhì)干擾（如高蛋白、高脂肪樣品可能導致假陽性）。
適用場景：食品企業(yè)生產(chǎn)線現(xiàn)場篩查、基層監(jiān)管快速排查、應急檢測初篩。
2、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）
（1）原理
基于抗原 - 抗體特異性結(jié)合與酶催化反應放大信號，分為直接 ELISA、間接 ELISA 或雙抗體夾心法（常用），通過酶標儀檢測吸光度值，判斷是否存在目標菌。
（2）操作流程（雙抗體夾心法）
包被：將單增李斯特菌特異性捕獲抗體包被酶標板，4℃過夜。
封閉：加入封閉液（如牛血清白蛋白），37℃孵育 1h，阻斷非特異性結(jié)合位點。
加樣：加入經(jīng)增菌培養(yǎng)的樣品液，37℃孵育 1h，目標菌與捕獲抗體結(jié)合。
加酶標抗體：加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，37℃孵育 1h。
顯色：加入底物，37℃孵育 15 分鐘，酶催化底物顯色。
終止與讀數(shù)：加入終止液（硫酸），酶標儀檢測 450nm 吸光度值，吸光度≥臨界值為陽性。
（3）優(yōu)缺點與適用場景
優(yōu)點：快速（4-6 小時，含增菌）、靈敏度較高（檢測限約 10³-10? CFU/mL）、可批量檢測（96 孔板）、客觀定量。
缺點：需酶標儀（設備成本）、易受食品基質(zhì)（如色素、蛋白質(zhì)）干擾、假陽性率略高于傳統(tǒng)方法。
適用場景：食品企業(yè)批量樣品篩查、實驗室快速檢測、大規(guī)模流行病學調(diào)查。
3、免疫磁珠分離法（IMS）+ 其他方法聯(lián)用
（1）原理
免疫磁珠表面偶聯(lián)
單增李斯特菌特異性抗體，可從復雜食品基質(zhì)中特異性捕獲目標菌，通過磁場分離磁珠 - 細菌復合物，實現(xiàn)目標菌的富集和純化，再結(jié)合 ELISA、PCR 或培養(yǎng)法檢測，提高靈敏度。
（2）操作流程
樣品均質(zhì)后，加入免疫磁珠，室溫孵育 30 分鐘，磁珠與目標菌結(jié)合。
磁場分離：將離心管置于磁力架上，棄上清液，用洗滌液洗滌 3 次，去除雜菌和基質(zhì)干擾。
洗脫：加入洗脫液，分離磁珠與細菌，獲得純化的目標菌懸液。
后續(xù)檢測：將洗脫液接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)，或進行 ELISA、PCR 檢測。
（3）優(yōu)缺點與適用場景
優(yōu)點：顯著提高靈敏度（檢測限可達 10² CFU/mL）、減少基質(zhì)干擾、縮短增菌時間（可省略一級增菌）。
缺點：成本較高（免疫磁珠價格昂貴）、操作步驟略繁瑣。
適用場景：低污染水平食品檢測、復雜基質(zhì)食品（如高鹽、高脂肪食品）檢測、快速方法的靈敏度提升。
三、分子生物學方法（精準度高，適用于溯源與快速確認）
分子生物學方法基于
單增李斯特菌特異性基因，通過核酸擴增或測序?qū)崿F(xiàn)快速、精準檢測，靈敏度和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，適用于爆發(fā)疫情溯源、高靈敏度檢測需求。
1、聚合酶鏈式反應（PCR）及其衍生技術(shù)
（1）核心原理
針對單增李斯特菌特異性基因（如 hlyA 基因：編碼溶血素 O，毒力基因；inlA 基因：編碼內(nèi)化素 A，特異性基因）設計引物，通過 PCR 擴增目標基因片段，經(jīng)凝膠電泳或熒光檢測確認是否存在目標菌。
（2）常用技術(shù)類型及操作
技術(shù)類型 原理與特點 操作流程 檢測限
常規(guī) PCR（凝膠電泳法） 普通 DNA 擴增，凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，紫外燈下觀察條帶 1.樣品前處理：均質(zhì)后煮沸裂解或試劑盒提取 DNA；2.PCR 擴增：95℃變性、55-60℃退火、72℃延伸，30-35 個循環(huán)；3.電泳：1% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察目標條帶 10²-10³ CFU/mL（需提取 DNA）
實時熒光 PCR（qPCR） 擴增過程中加入熒光染料或特異性探針，實時監(jiān)測熒光信號，定量檢測 1.DNA 提取；2.熒光 PCR 反應：在實時熒光定量 PCR 儀中進行，設置熒光閾值；3.結(jié)果判斷：Ct 值≤臨界值為陽性，可定量分析菌量 10¹-10² CFU/mL（靈敏度更高，無需電泳）
巢式 PCR 兩輪 PCR 擴增，第一輪用外引物擴增，第二輪用內(nèi)引物擴增第一輪產(chǎn)物，提高特異性和靈敏度 同常規(guī) PCR，增加一輪內(nèi)引物擴增步驟 10?-10¹ CFU/mL（適用于極低污染樣品）
（3）優(yōu)缺點與適用場景
優(yōu)點：快速（2-4 小時，含 DNA 提?。㈧`敏度高、特異性強（基因水平鑒定，無交叉反應）、可定量（qPCR）。
缺點：需專業(yè)設備（PCR 儀/熒光定量 PCR 儀）、DNA 提取步驟復雜（易受食品基質(zhì)中抑制物）、成本較高、假陽性風險（擴增產(chǎn)物污染）。
適用場景：爆發(fā)疫情溯源（結(jié)合測序）、高靈敏度檢測（如嬰幼兒食品、即食食品）、實驗室精準確認。
2、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）
（1）原理
針對目標基因設計 4-6 條特異性引物，在 60-65℃等溫條件下，通過 Bst DNA 聚合酶擴增 DNA，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀（白色渾濁）或結(jié)合熒光染料，實現(xiàn)可視化檢測。
（2）優(yōu)缺點與適用場景
優(yōu)點：快速（30-60 分鐘）、無需 PCR 儀（僅需水浴鍋或等溫擴增儀）、靈敏度高（檢測限約 10¹ CFU/mL）、肉眼可讀（渾濁或熒光顯色）。
缺點：引物設計復雜、易出現(xiàn)非特異性擴增（假陽性）、難以定量。
適用場景：現(xiàn)場快速檢測、基層實驗室檢測、應急檢測（無需昂貴設備）。
3、測序技術(shù)（全基因組測序 WGS）
（1）原理
通過提取單增李斯特菌基因組 DNA，進行全基因組測序，分析特異性基因（毒力基因、耐藥基因）和單核苷酸多態(tài)性（SNP），實現(xiàn)菌株分型和溯源。
（2）適用場景
爆發(fā)疫情溯源：通過比較不同污染食品、患者分離菌株的基因組序列，確認污染源頭和傳播路徑。
菌株特性分析：鑒定毒力基因、耐藥基因，評估菌株致病性。
優(yōu)點：精準度極高（金標準級分型）、可提供全面菌株信息；缺點：成本高、耗時久（1-3 天）、需專業(yè)生物信息學分析。
四、其他新型檢測技術(shù)（前沿方向，逐步推廣）
1、生物傳感器技術(shù)
原理：將單增李斯特菌特異性抗體或核酸探針固定在傳感器表面，目標菌與探針結(jié)合后，引發(fā)傳感器信號（如電流、熒光強度）變化，實現(xiàn)快速檢測。
類型：電化學傳感器（檢測限約 10² CFU/mL，30 分鐘）、表面等離子體共振（SPR）傳感器（檢測限約 10¹ CFU/mL，1 小時）、量子點標記傳感器（靈敏度更高，可視化）。
優(yōu)點：快速、高靈敏度、可實時檢測；缺點：設備昂貴、易受基質(zhì)干擾，尚未普及。
2、拉曼光譜法
原理：
單增李斯特菌具有獨特的拉曼光譜指紋圖譜，通過拉曼光譜儀檢測樣品，與標準圖譜比對，實現(xiàn)快速鑒定。
優(yōu)點：快速（5-10 分鐘）、無需樣品預處理（或簡單預處理）、非破壞性檢測；缺點：靈敏度較低（需 10? CFU/mL 以上）、易受雜菌干擾，適用于純培養(yǎng)物鑒定。
3、微流控芯片技術(shù)
原理：將樣品處理、核酸提取、PCR 擴增、檢測等步驟集成在微芯片上，實現(xiàn)“一站式”檢測，體積小、耗材少、速度快。
優(yōu)點：快速（1 小時內(nèi)完成全流程）、高通量、自動化；缺點：技術(shù)門檻高、成本高，目前主要用于科研和高端檢測。
五、檢測方法的選擇與質(zhì)量控制要點
1、方法選擇原則
官方監(jiān)管/仲裁：優(yōu)先選擇傳統(tǒng)標準方法（GB 4789.30-2022、ISO 11290-1），確保結(jié)果權(quán)威性。
食品企業(yè)現(xiàn)場篩查：選擇免疫膠體金層析法、LAMP 法（快速、簡便）。
高靈敏度需求（如嬰幼兒食品、即食食品）：選擇 qPCR、IMS+ELISA/PCR 聯(lián)用技術(shù)。
爆發(fā)疫情溯源：選擇 qPCR + 全基因組測序。
2、關(guān)鍵質(zhì)量控制要點
陽性對照：使用單增李斯特菌標準菌株作為陽性對照，確保檢測系統(tǒng)有效。
陰性對照：設置空白對照（無樣品）、陰性對照（非單增李斯特菌菌株，如大腸桿菌 ATCC 25922），排除假陽性。
樣品前處理：嚴格按照標準流程均質(zhì)、稀釋，避免基質(zhì)干擾（如高脂肪樣品需脫脂處理，高鹽樣品需稀釋）。
增菌培養(yǎng)：控制溫度、時間準確，避免增菌不充分或雜菌過度生長。
設備校準：PCR 儀、酶標儀、培養(yǎng)箱等定期校準，確保檢測精度。
六、總結(jié)
食品中
單核細胞增生李斯特菌的檢測方法可分為“傳統(tǒng)標準方法（金標準，適用于權(quán)威檢測）、快速免疫方法（適用于現(xiàn)場篩查）、分子生物學方法（適用于精準檢測與溯源）、新型傳感器技術(shù)（前沿方向）”四類。實際應用中需根據(jù)檢測目的、設備條件、樣品類型選擇合適方法，且快速方法陽性結(jié)果需通過傳統(tǒng)標準方法確認，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。核心趨勢是“快速化、高靈敏度、自動化”，將逐步成為食品微生物檢測的主流方向。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的
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